一种游离肼的检测方法及其在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用技术

本发明专利技术提供一种基于离子色谱法的游离肼的检测方法，色谱条件为：色谱柱：Thermo Dionex IonPac CS12A色谱柱，250mm*4mm；保护柱：Thermo Dionex IonPac CG12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器CERS 4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min‑1.3ml/min；柱温：28℃‑35℃；进样量：25ul。该检测方法的最低线性检出浓度为0.18μg/ml，最低检出浓度为0.05μg/ml。本发明专利技术还提供上述检测方法在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。

A Method for the Detection of Free Hydrazine and Its Application in the Impurity Detection of Sigliptin Phosphate

The present invention provides a method for the determination of free hydrazine based on ion chromatography. The chromatographic conditions are as follows: Thermo Dionex IonPac CS12A column, 250mm*4mm; Protective column: Thermo Dionex IonPac CG12 column, 4mm*50mm; Cation Suppressor CERS 4mm; Detector: Conductivity Detector; Mobile phase: 5mmol/l methane sulfonic acid; Flow rate: 0.8ml/min_1.3ml/min; Column; Temperature: 28 35 Sampling volume: 25 ul. The minimum linear detection concentration was 0.18 ug/ml and the minimum detection concentration was 0.05 ug/ml. The invention also provides the application of the above detection method in the impurity detection of Sigliptin phosphate raw material drug.

【技术实现步骤摘要】
一种游离肼的检测方法及其在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种游离肼的检测方法及其在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。
技术介绍
糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病，包括胰岛素依赖型糖尿病(Ⅰ型糖尿病)、非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型糖尿病，占比90％)及妊娠期糖尿病。国际糖尿病联盟发布的全球糖尿病地图(第8版)显示，2017年全球糖尿病患病率(20～79岁)大约为8.8％，约有4.25亿成人糖尿病患者，到2045年，这一数字可能达到6.29亿。中国是糖尿病患者人数最多的国家，约占世界总数的四分之一。糖尿病作为一种高发慢性病，具有病情不可逆、后期并发症多等特点。血糖若控制不佳，糖尿病慢性化可引发糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等并发症，造成肾衰、失明等严重后果，给社会和家庭造成巨大负担。同时，糖尿病也是引起众多心血管疾病的危险因素，如心肌梗死、脑卒中等。相关降糖机制研究表明，人体内血糖升高时可促进活性肠促胰岛激素胰高血糖素样肽-1(GLP-l)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌肽(GIP)的分泌，进而激发胰岛素的合成分泌过程，最终达到控制血糖的效果。体内的GLP-1和GIP容易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解失活；因此，二肽基肽酶IV成为糖尿病治疗的靶点。磷酸西格列汀是首个获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶-4抑制剂(DPP-4抑制剂)，可有效抑制胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)的灭活，提高内源性GLP-1和GIP的水平，促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不易诱发低血糖和增加体重。磷酸西格列汀，化学名称：7-[(3R)-3-氨基-1-氧-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氢-3-(三氟甲基)-1,2,4-三唑酮[4,3-a]吡嗪磷酸盐(1:1)一水合物，化学分子式C16H15F6N5O·H3PO4·H2O，化学结构如式(I)所示。水合肼(NH2NH2·xH2O)是磷酸西格列汀合成的起始物料之一，如果合成反应不充分，很可能导致磷酸西格列汀原料药中残留杂质游离肼。由于含量极微，一直未纳入磷酸西格列汀杂质的检测项目。2018年7月欧盟药品局(EMA)发布公告，华海药业供应的缬沙坦原料未知杂质中发现极微量的基因毒性杂质亚硝基二甲胺(以下称NDMA)，并据此在成员国召回使用华海药业供应缬沙坦原料生产的药品。此事件后，公众对药品原料中的极微量杂质和药品安全给予了极大的关注。游离肼(NH2NH2)是一种基因毒性杂质，为确保用药安全性，有必要对磷酸西格列汀原料药中的游离肼进行定性和定量检测。现有技术有报道的针对肼类物质的检测方法有：(1)紫外分光光度法：由于游离肼的特殊结构，无发色团，因而其无紫外吸收，无法直接采用紫外检测器测定，一般需衍生化处理后再进行紫外检测。如：公开号CN102478521A的中国专利申请，利用游离肼与对二甲氨基苯甲醛发生反应，生成黄色的缩合物，于456nm波长处用紫外分光光度计检测氨氯地平类药物中游离肼含量。该方法操作繁琐，且灵敏度不高。(2)高效液相色谱法：由于游离肼的极性较大，在一般的反相液相色谱保留时间过短，需采用强极性填料或者离子交换填料的色谱柱，并需要强离子对试剂洗脱。如公布号CN101858894B的中国专利技术专利，以磺酸基键合与十八烷基键合的混合填料为固定相，以有机相(甲醇或乙腈)和水相(磷酸盐缓冲液或高氯酸盐缓冲液)组成的混合溶液为流动相，对米屈肼同时进行离子交换色谱和反相色谱洗脱。(3)气相色谱法：公开号CN103698459A的中国专利技术专利申请公开了先使游离肼在酸性条件下与丙酮发生反应，然后利用气相色谱检测衍生物4-甲基-3-戊烯-2-酮腙。由于需要衍生化，该方法操作较繁琐，耗时较长；且丙酮有一定的毒性，对环保不利。(4)荧光探针技术：公布号CN106431986B的中国专利技术专利公开了一种利用荧光探针分子检测游离肼的方法，但该方法仅能实现定性检测，无法进行定量测定。(5)离子色谱法：离子色谱法是近年来检测极性大、离子型化合物的热门方法。早在1992年，王永强就报道了采用Dionex2020i离子色谱仪、安培检测器、HPIC-CG1前置柱，HPIC-CS1分析柱，以0.005mol/L赖氨酸/0.003mol/L盐酸为淋洗溶液测定水和污水中的微量肼(王永强；离子色谱法测定水和污水中微量肼；科技通报；1992年11月，第8卷第6期：354-357)。王勇等以去离子水作为尘土中肼离子的提取剂，经OnGuardIIRP小柱和0.22μm过滤膜过滤后，以5mmol/L甲基磺酸为淋洗液，采用IonPacCS-12A离子交换色谱柱进行分离，并在柱后加碱后采用金电极安培检测器检测；该方法检出限为5.0μg/L,定量限为16.6μg/L(王勇，耿庆，等；离子色谱法检验液体炸药爆炸尘土中的肼离子；《色谱》，2013，第31卷第9期：920～923)。但是现有技术中还有对磷酸西格列汀原料药中极微量游离肼进行检测的相关报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种游离肼的检测方法，以及该方法在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。具体地说，本专利技术提供一种基于离子色谱法检测游离肼的方法，以及该方法在磷酸西格列汀原料药中游离肼定性定量检测中的应用。本专利技术的方法无需对被检样品进行衍生化，无需特定的色谱柱填料，不使用有机溶剂，对环境无污染。而且本方法便捷、灵敏、检测成本低，游离肼最低线性检出浓度为0.18μg/ml，以信噪比3:1确定的最低检出浓度为0.05μg/ml；出峰时间在10min左右。且通过加样回收实验表明，供试品溶液中其他成分对游离肼的检测无干扰。本专利技术可实现在磷酸西格列汀原料药中快速、有效检测游离肼的目的，填补现有技术空白。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术手段：一种游离肼的检测方法，所述方法基于离子色谱法，包括：色谱条件的建立：色谱柱：ThermoDionexIonPacCS12A色谱柱，250mm*4mm；保护柱：ThermoDionexIonPacCG12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器CERS4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min-1.3ml/min；柱温：28℃-35℃；进样量：25ul。优选地，所述流速为1.0ml/min。根据色谱柱性能，所述柱温优选为32℃。本专利技术的检测方法，还包括对照品溶液的制备，具体步骤包括：精密量取硫酸肼适量，用超纯水或去离子水溶解并稀释成每1ml约含0.9μg游离肼的溶液，即得。本专利技术的检测方法，供试品溶液的制备也采用超纯水或去离子水作为溶剂。本专利技术的检测方法，还包括定性检测和/或定量测定，具体步骤包括：定性检测：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图；与对照品溶液的色谱图比较，观察供试品溶液的色谱图中是否在相应的保留时间出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离肼的检测方法，所述方法基于离子色谱法，包括：色谱条件的建立：色谱柱：Thermo Dionex IonPac CS12A色谱柱，250mm*4mm；保护柱：Thermo Dionex IonPac CG12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器CERS 4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min‑1.3ml/min；柱温：28℃‑35℃；进样量：25ul。

【技术特征摘要】
1.一种游离肼的检测方法，所述方法基于离子色谱法，包括：色谱条件的建立：色谱柱：ThermoDionexIonPacCS12A色谱柱，250mm*4mm；保护柱：ThermoDionexIonPacCG12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器CERS4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min-1.3ml/min；柱温：28℃-35℃；进样量：25ul。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流速为1.0ml/min。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱温为32℃。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括对照品溶液的制备，具体步骤包括：精密量取硫酸肼适量，用超纯水或去离子水溶解并稀释成每1ml约含0.9μg游离肼的溶液，即得。5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括定性检测和/或定量测定，具体步骤包括：定性检测：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图；与对照品溶液的色谱图比较，观察供试品溶液的色谱图中是否在相应的保留时间出现相应的色谱峰；定量测定：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，按外标法计算供试品溶液中游离肼的含量。6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法对游离肼的最低线性检出浓度为0.18μg/ml，以信噪比3:1确定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷春生，王广祁，宁科权，王健，盛永强，
申请(专利权)人：通化东宝药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林,22