采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒，本发明专利技术利用固定数量的磁珠捕获DNA分子，使得获取固定量的DNA分子变得容易，后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可，省去了前期处理的测DNA浓度，测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤，大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程，可以实现自动化操作，成本低，实用性强。

Standardized method and kit for DNA sequencing library by magnetic bead mixing

The invention discloses a standardization method and kit for sequencing library using magnetic beads to process DNA. The method captures DNA molecule with a fixed number of magnetic beads, making it easy to obtain a fixed amount of DNA molecule. In subsequent mixed samples, only the on-line sequencing data of each sample need to be allocated according to the molar ratio of DNA molecule, thus eliminating the pre-processing DNA concentration and DNA text testing. The cumbersome steps such as Cuomor concentration greatly simplify the process of pre-sequencing for many different DNA libraries, which can realize automatic operation, low cost and high practicability.

【技术实现步骤摘要】
采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体地指一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒。
技术介绍
现有的自动化上机测序文库的标准化操作中，多个不同样本DNA文库构建成功后，需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。具体地讲，一般地的上机测序过程是：DNA文库先经过qubit测定DNA浓度、qPCR测定DNA文库摩尔浓度、Bioanalyzer分析DNA分子片段大小等检测后，确定DNA库准确的分子摩尔量；一张测序芯片lane的总数据量是一定的；如果多个样品DNA预期获取的测序数据量不同，那么要获得准确的下机测序数据就需要准确分配每个样品DNA的摩尔比例即可。目前上述方法存在几个大问题：需要大量检测实验、较多的人工操作、不能自动化操作、成本高等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种可以不依赖繁琐的检测步骤、包含较少人工干预、可以实现自动化操作的采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒，大大提高工作效率、显著降低成本。为实现上述目的，本专利技术提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法，其步骤如下：1)消化过程：对DNA文库中的DNA分子，利用外切酶从DNA分子末端消除碱基，暴露出黏性末端；2)捕获过程：2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合，其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠，所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合(DNA结合片段所包含的序列可以特异性地与文库末端序列(如P5/P7序列)结合)；2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉FlapDNA结构，再用DNA连接酶将缺刻连接起来；3)漂洗过程：将已捕获DNA分子的磁珠吸附在磁力架上，使用磁珠漂洗缓冲液洗掉未结合的DNA分子；4)混样：针对多个不同样本DNA文库，通过的重复步骤1)～3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠，并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起；5)洗脱：使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子，得到可上机测序的文库样本。上述方案中，所述磁珠为链霉素亲和磁珠，它通过生物素与DNA结合片段相连。本专利技术还提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒，它的应用对象为具有黏性末端的DNA分子，包括如下组分：(1)用于结合生物素修饰的DNA分子的链霉素亲和磁珠；所述链霉素亲和磁珠通过生物素修饰分子结合有DNA结合片段，所述DNA结合片段包括特殊修饰碱基、DNAlinker、用于结合目标DNA分子的特异性DNA序列；所述特殊修饰碱基为用于在特殊条件下释放目标DNA的碱基；所述DNAlinker的长度为1～100bp；所述特异性DNA序列的长度为3～200bp，特异性结合DNA分子在被消化后暴露的黏性末端；(2)工具酶所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶；(3)工具酶反应体系各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液；(4)磁珠漂洗缓冲液所述磁珠漂洗缓冲液用于漂洗磁珠，洗掉未结合的DNA分子；(5)DNA洗脱液所述DNA洗脱液用于从磁珠上洗脱目标DNA分子。优选地，所述DNA结合片段从5’到3’依次为DNAlinker、特殊修饰碱基、特异性DNA序列。可选地，所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶；所述外切酶，不限于ExoI,ExoIII,ExoT5,lambdaExo，ExoT7等；所述DNA聚合酶，不限于Taq聚合酶、Phusion等具有DNA合成功能的聚合酶；所述DNA连接酶，不限于T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、TaqDNA连接酶、E.coliDNA连接酶等；所述DNA内切酶，不限于UDG、EndoVIII、EndoIV、Fpg等；优选地，所述特殊修饰碱基还包括用于防止链延伸的碱基和/或防止目标DNA文库的3’端OH延伸的碱基。可选地，所述特殊修饰碱基不限于dUTP、8-oxo-dGTP、dITP、AP位点、RNA碱基等。测序文库的标准过程是多个不同样本DNA文库构建成功后，需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。本专利技术的有益效果：利用固定数量的磁珠捕获DNA分子，使得获取固定量的DNA分子变得容易，后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可，省去了前期处理的测DNA浓度，测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤，大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程，可以实现自动化操作，成本低，实用性强。附图说明图1为本专利技术方法的原理图。图2为本专利技术方法中的标准捕获试剂消化能力测试。图3为本专利技术方法的NGS文库标准化效果测试。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。以下实施例是在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：DNA文库构建本实施例中，使用ABclonal商业化RapidMaxDNALibPrepKitforillumina(RK20217)构建DNA文库，最终的DNA文库使用三种不同化学修饰的PCR引物进行文库扩增。第一种PCR引物对是TPC1primer(5’-AATGATACGGCGACCACCGAG-3’)/TPC2Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’)；第二种PCR引物对是TPC1*primer(5’-AATGATACGGCGACCACCGA*G-3’)/TPC2*Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G-3’)；第三种PCR引物对是S4TPC1primer(5’-A*A*T*G*ATACGGCGACCACCGAG-3’)/S4TPC2Primer(5’-C*A*A*G*CAGAAGACGGCATACGAG-3’)。*代表硫代修饰的磷酸硫脂键。具体的文库准备步骤详见商业化试剂盒操作说明书。以下所示是基本的DNA文库构建步骤：1EndPrepReaction1.1配制反应体系如下1.2运行反应程序20℃/30min,65℃/30min,4℃/hold.2Ligation2.1配制反应体系如下2.2运行反应程序20℃/15min,12℃/hold.3Post-ligationCleanup按照1.0xAMPureXP磁珠比例进行DNA纯化。21μl洗脱磁珠。取20μladapter-ligatedDNA用于后续PCR反应。4PCR4.1配制反应体系如下4.2运行反应程序98℃/45s；8cycles(98℃/10s,60℃/30s,72℃/30s)；72℃/1min；4℃/hold.5Post-PCRCleanup使用1.0xAMPureXPDNA纯化磁珠进行DNA的PCRcleanup。31μl水洗脱磁珠。取30μlDNA文库。Qubit定量，三种文库的产量基本一致，没有显著差异。实施例2：DNA文库消化能力测试本实施例使用的是尚未商业化的标准捕获试剂，组成是50mMTrisHClpH7.9，5UexonucleaseT7,2UPhusion,120UE.coliDNAli本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法，其步骤如下：1)消化过程：对DNA文库中的DNA分子，利用外切酶从DNA分子末端消除碱基，暴露出黏性末端；2)捕获过程：2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合，其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠，所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合；2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉Flap DNA结构，再用DNA连接酶将缺刻连接起来；3)漂洗过程：将已捕获DNA分子的磁珠吸附在磁力架上，使用磁珠漂洗缓冲液洗掉未结合的DNA分子；4)混样：针对多个不同样本DNA文库，通过的重复步骤1)～3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠，并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起；5)洗脱：使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子，得到可上机测序的文库样本。

【技术特征摘要】
1.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法，其步骤如下：1)消化过程：对DNA文库中的DNA分子，利用外切酶从DNA分子末端消除碱基，暴露出黏性末端；2)捕获过程：2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合，其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠，所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合；2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉FlapDNA结构，再用DNA连接酶将缺刻连接起来；3)漂洗过程：将已捕获DNA分子的磁珠吸附在磁力架上，使用磁珠漂洗缓冲液洗掉未结合的DNA分子；4)混样：针对多个不同样本DNA文库，通过的重复步骤1)～3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠，并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起；5)洗脱：使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子，得到可上机测序的文库样本。2.根据权利要求1所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法，其特征在于：所述磁珠为链霉素亲和磁珠，它通过生物素与DNA结合片段相连。3.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒，它的应用对象为具有黏性末端的DNA分子，包括如下组分：(1)用于结合生物素修饰的DNA分子的链霉素亲和磁珠；所述链霉素亲和磁珠通过生物素修饰分子结合有DNA结合片段，所述DNA结合片段包括特殊修饰碱基、DNAlinker、用于结合目标DNA分子的特异性DNA序列；所述特殊修饰碱基为用于在特殊条件下释放...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯延叶，赖煦卉，孙大鹏，赵骞，吴知才，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42