海洋微生物节杆菌YJ34产右旋糖酐酶基因及其重组工程菌制造技术

本发明专利技术是一种海洋微生物节杆菌(Arthrobacter sp.)YJ34产右旋糖酐酶基因，该酶基因序列全长1923bp，以ATG为起始密码子，以TAG为终止密码子，GC碱基含量为59.23％。本发明专利技术还公开了前述右旋糖酐酶基因克隆及在大肠杆菌的高效表达得到的右旋糖酐酶基因重组工程菌。本发明专利技术属于酶学与酶工程技术领域，通过基因克隆与测序，构建重组工程菌，诱导表达，重组酶的纯化，获得纯化的重组酶。大大地提高了酶活力和酶稳定性。通过酶学性质测定该酶最适反应温度为55℃，最适作用pH为7.5。

Dextran Gene Produced by Marine Microorganism Arthrobacter YJ34 and Its Recombinant Engineering Bacteria

The present invention is a dextran anhydrase gene produced by Arthrobacter sp. YJ34, a marine microorganism. The full length of the gene sequence is 1923 bp, ATG is the starting codon, TAG is the terminating codon, and the GC base content is 59.23%. The invention also discloses the cloning of the dextran anhydrase gene and the recombinant engineering strain of the dextran anhydrase gene which is highly expressed in E. coli. The invention belongs to the field of enzymology and enzymatic engineering technology. Through gene cloning and sequencing, the recombinant engineering bacteria are constructed, expressed, purified and purified. Enzyme activity and stability were greatly improved. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 55 C and 7.5 respectively.

【技术实现步骤摘要】
海洋微生物节杆菌YJ34产右旋糖酐酶基因及其重组工程菌
本专利技术涉及一种海洋节杆菌(Arthrobactersp.)YJ34产的右旋糖酐酶基因，以及海洋微生物节杆菌YJ34产右旋糖酐酶基因克隆及在大肠菌种的高效表达得到的重组工程菌，属于酶学与酶工程

技术介绍
海洋节杆菌(Arthrobactersp.)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，麸皮等工农业废料上生长，容易实现大规模的培养，且具有右旋糖酐酶活性。但是由于该酶是诱导酶，在生长对数期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差，菌体不能长时间、重复利用，导致生产成本居高不下。为提高酶活力和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，构建工程菌，用于规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种海洋节杆菌(Arthrobactersp.)YJ34右旋糖酐酶基因。本专利技术的另一个目的是通基因克隆及在大肠杆菌中高效表达的方法获得海洋微生物节杆菌YJ34产右旋糖酐酶基因的重组工程菌。本专利技术所涉及的海洋节杆菌(Arthrobactersp.)YJ34是从连云港近海海域样本分离筛选获得的，菌种保藏于中科院微生物保藏中心，保藏号为CGMCCN0.7385。本专利技术是通过以下技术方案来实现的。本专利技术是一种海洋微生物节杆菌(Arthrobactersp.)YJ34产右旋糖酐酶基因，其特点是：该右旋糖酐酶基因序列如SEQIDNO.1所示：atgcccggaacagggctgggccgattggccaaacgcatgacagcggccgccgccgtcttc60cttatcagcagtggcgccgtcctcccggcgcaggcagccacgacagcggggcacaccccc120tctacggcgcctgctgcgcctaccgacaaacacgccattaccactgcggacaacggcaac180cttcacacctggtggcatgacaacgccgttttcaacaccaccggcccaactggcaacgac240gaagtgcggcggtcctccttctacgacctgcaggtggcccaggagaaccagccggacaag300gcttatgacgccttcacttacatgagcatcccccgcagcggcaaggacaagatcggctac360accaaggaagacggcgccgaattctcctcccaggccggccttaccatgagctggtccagc420ttcgaatatgccaaagacgtctgggtggacgtaagcctccgcaccggccagaccatcacc480tcagcggaccaggtgcagatccgccccagcagctacaacttcgaaaagcagctcgttgac540gcggacaccgtcaaaatcaaagtgccctactccgatgccggctaccggttctcagtggaa600ttcgagccacagttgtatacggcctacaacgacatgtccggggacagcggcaagctgacc660accgaagccgagggcaaccgcgccatccacaccgaaccccgcaattcaatgatgatcttc720gcggaacctaaactccgcggagagcaaaaggaacgattggttcccacagaggagtcgggc780agcatccattaccctgccgaaggtgaggtgaccaacctcaatgccgttaccgaggaaatc840atctacttcaagcccggcacctacagcatgggatcggactaccacgcggtcctgccgccc900aacgtcaagtgggtctacctggcaccgggcgcttacgtaaagggagccttccggttcctc960catgacaaccagagccagtacaaggtcaccggctacggtgtcctctccggcgagcagtac1020gtgtacgaggcagacaccaataacaactacaaccacctcagcggagcgtccaactgccac1080tcgtcgtgcgtgaagatgctgcagttcgcttccgccgatgccgagcagaagctggacctt1140cagggcgttactgtcgccgagcccccgtaccactcctttgtggtctacggaaacgagcag1200accttccacatgaacgttgagaactacaagcaggtgggcagctggtactggcagaccgac1260ggcatcgaactgtacaagggcagcaccatgaagaacaccttcttcaacgcgaacgacgac1320gtgctgaagatgtaccacagcgacgtcaccatcgataacaccgtgatttggaagaacgag1380aacggacccgtgatccagtggggctggacgccccggaacatcgacaacgtgaacgtcacc1440aacaccacggtcatccacaaccggatgtactggaaggacgtcaagtacaacacctgcatc1500ctgaactcctcgtcgcactgggaagacatgggttccaccaccaaggcggatcccaacacc1560accgtgaagaacatgcgcttcgagaacatcacggtggagggcatgaccaactgtgccatc1620cgcgtctatgccctctccgataccgagaacatccacgtgaaaaacctcaacatcgacgct1680tggaacgggctggactggacctcacaggtcagccacctcaagcgctacaccaaccctgcc1740ggcgaaaaagtcacaatcggaaacgagattcctgacggcaacggactagccctggagaac1800tactccgtgggcggcgaagtgatcgaaaaaaccgccgacaactgggccgaccaccagctg1860ggccgcatcggcttcgacggcgaaaactggaacagctggaacgcctggcggaccaccccg1920tag1923。本专利技术还提供了一种右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特点是，该重组工程菌由以上所述的右旋糖酐酶基因克隆并构建重组大肠杆菌得到。构建的克隆载体和表达载体分别为pMD-18T-Dextranase和pET-21a(+)-Dextranase。克隆菌株和表达菌株分别为DH5α和BL21(DE3)。以大肠杆菌为宿主菌由IPTG进行诱导表达，用SDS-PAGE用于鉴定表达。采用葡聚糖7万进行酶活性测定底物。用NI亲和层析法纯化重组酶。以上所述的本专利技术右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特点是：具体克隆与重组表达方法如下：（1）菌株培养与基因组DNA提取：菌株培养，取冰箱培养的海洋节杆菌YJ34100μl接入装有培养基的三角瓶中，30℃培养18-20h，采用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用DNA二代测序技术对该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋微生物节杆菌(

【技术特征摘要】
1.一种海洋微生物节杆菌(Arthrobactersp.)YJ34产右旋糖酐酶基因，其特征在于：该右旋糖酐酶基因序列如SEQIDNO.1所示。2.一种右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于，该重组工程菌由权利要求1所述的右旋糖酐酶基因克隆并构建重组大肠杆菌得到。3.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：构建克隆载体为pMD-18T-Dextranase和pET-21a(+)-Dextranase。4.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：克隆菌株和表达菌株分别为DH5α和BL21(DE3)。5.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：以大肠杆菌为宿主菌由IPTG进行诱导表达，用SDS-PAGE用于鉴定表达。6.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：采用葡聚糖7万进行酶活性测定底物。7.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：用NI亲和层析法纯化重组酶。8.根据权利要求2所述的右旋糖酐酶基因重组工程菌，其特征在于：具体克隆与重组表达方法如下：（1）菌株培养与基因组DNA提取：菌株培养，取冰箱培养的海洋节杆菌YJ34100μl接入装有培养基的三角瓶中，30℃培养18-20h，采用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，用DNA二代测序技术对该基因组DNA进行扫描测序，获得如SEQIDNO.1所示的右旋糖酐酶基因序列；（2）右旋糖酐酶基因重组菌构建：采用引物:primerF：5′-GGGAATTCCATATGAAGCATTACCTCCGTCTA-3′primerR：5′-CCCAAGCTTCCACGCGTTCCAGTTATCCCA-3′，PCR条件：95℃预变性5min，95℃变性30sec，55℃退火30sec...

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑军，刘红飞，任伟，吕明生，房耀维，刘姝，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32