一种利托菌素磁珠、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利托菌素磁珠、制备方法及其应用，将Fe3O4纳米磁珠与利托菌素溶液混合后在室温下搅拌8～27h，得到表面包覆利托菌素的Fe3O4纳米磁珠，即利托菌素磁珠，该利托菌素磁珠包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的利托菌素；可用于样品中的肺炎球菌。通过本发明专利技术制备的利托菌素磁珠对肺炎球菌具有特异性，在吸附过程中能够与肺炎球菌细胞壁结合，具有准确性高、操作简便和特异性强等优势，能够从较为复杂、细菌含量极低的样品中快速分离富集肺炎球菌，提高了肺炎球菌的检测效率和阳性率。

A Liptomycin Magnetic Bead, Its Preparation Method and Application

The invention discloses a kind of ritomycin magnetic beads, a preparation method and its application. Fe3O4 nanomagnetic beads are mixed with ritomycin solution and stirred at room temperature for 8-27 hours to obtain a Fe3O4 nanomagnetic beads coated with ritomycin, i.e. ritomycin magnetic beads. The ritomycin magnetic beads include Fe3O4 nanomagnetic beads and ritomycin coated on the surface of Fe3O4 nanomagnetic beads, which can be used in samples. Pneumococcus. The ritomycin magnetic beads prepared by the invention have specificity to pneumococcus, can bind to the cell wall of pneumococcus in the adsorption process, has the advantages of high accuracy, simple operation and strong specificity, can quickly isolate and enrich pneumococcus from relatively complex samples with very low bacterial content, and improve the detection efficiency and positive rate of pneumococcus.

【技术实现步骤摘要】
一种利托菌素磁珠、制备方法及其应用
本专利技术属于纳米材料和细菌检验
，具体涉及一种利托菌素磁珠、制备方法及其应用。
技术介绍
肺炎球菌(Spn)为革兰氏阳性菌，属链球菌属，由于经常成双排列，故又名肺炎链球菌。Spn是一种重要的条件致病菌，寄生在健康人鼻咽部，正常情况下并不致病，当寄生的环境发生变化时，如机体抵抗力下降时，麻疹、流感等呼吸道病毒感染以后，或营养不良、老年体弱等情况下，Spn将透过黏膜防御体系发生侵袭性感染，可进入下呼吸道引起肺炎，可穿过血脑屏障引起细菌性脑膜炎，也可穿过肺泡上皮细胞、侵袭血管内皮细胞进入血液引起菌血症，还可从鼻咽部移行进入鼻窦，引起鼻窦炎，通过咽鼓管进入中耳，引起中耳炎。根据Spn感染部位不同，可分为侵袭性肺炎球菌性疾病(IPD)和非侵袭性肺炎球菌性疾病(NIPD)两大类。IPD是指Spn侵入原本无菌的部位和组织所引发的感染，主要包括脑膜炎、菌血症和菌血症性肺炎等。NIPD即Spn感染到原本与外环境相通的部位所引起的疾病，主要包括急性中耳炎、鼻窦炎和非菌血症性肺炎等。肺炎球菌可以导致95种少见的IPD感染，包括骨髓炎、心包炎、心内膜炎、腹膜炎、化脓性关节炎、胰腺脓肿、肝脓肿、牙龈感染、腹股沟淋巴结炎、卵巢脓肿、睾丸脓肿、坏死性筋膜炎、溶血尿毒症综合征等，严重威胁人类的生命安全。因此，对肺炎球菌进行快速准确的检测是非常必要的。目前，对肺炎球菌检测的主要方法包括培养法、免疫法、普通PCR(聚合酶链式反应)法或实时定量PCR法。一般，培养法是通过处理样品，在一定条件(如培养基、温度等)下培养，离心、过滤，洗涤实现细菌与样品分离的过程。其操作繁琐，易污染、耗时且浓缩效率低，检测吸附时间长，耽误治疗时机；免疫检测方法是一种基于抗原-抗体特异性结合反应原理的微生物快速分离富集技术，以其高度的靶标特异性在微生物快速检测中得到广泛应用，缩短了常规检测所需的增菌时间，但特异性差；普通PCR法或实时定量PCR法能够提供基因诊断的灵敏度，降低了分析的难度，但检测时间较长并且需要特定设备。而且，患者提供的样品中肺炎球菌的含菌量往往非常低，尤其是盥洗液中的只含有痕量的肺炎球菌，为诊断带来了极大的挑战。
技术实现思路
针对目前肺炎球菌快速检测中存在的局限性，本专利技术的目的是提供一种利托菌素磁珠、制备方法及其应用，解决现有的方法吸附肺炎球菌时灵敏度低、尤其对于痕量肺炎球菌吸附分离时间久和富集效率低的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案予以实现：一种利托菌素磁珠，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的利托菌素。本专利技术还公开了一种利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，包括：将Fe3O4纳米磁珠与利托菌素溶液混合后在室温下搅拌8～27h，得到表面包覆利托菌素的Fe3O4纳米磁珠，即利托菌素磁珠。具体的，所述的利托菌素经过预处理后与Fe3O4纳米磁珠混合，利托菌素的预处理过程为：将利托菌素和2,2,2-三氯乙醇共同混合在二氯甲烷溶液中，再加入催化剂和吸水剂，室温下搅拌0.5～4h；然后蒸发去除溶液中的二氯甲烷，得到初步预处理的利托菌素；将L-精氨酸溶于MES溶液中，再加入活化剂，室温下搅拌10～30min，得到活化后L-精氨酸溶液；将活化后L-精氨酸溶液加入到初次处理的利托菌素溶液中，室温下搅拌0.5～6h，得到预处理后的利托菌素溶液。具体的，所述的利托菌素和2,2,2-三氯乙醇的质量比为4～33:1；所述的L-精氨酸与利托菌素的质量比为1：2～10。具体的，所述的活化剂由EDC溶液和HNS溶液混合而成，所述的L-精氨酸与EDC和NHS按照物质的量为5:4:1的比例混合。具体的，所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶、硼酸、三乙基苄基氯化铵、对甲苯磺酸、硫酸铜或氧化锌；所述的吸水剂为二环己基碳二亚胺、醋酸酐、醋酸钠、五氧化二磷或硫酸钠；所述的催化剂、吸水剂和利托菌素的物质的量的比例为1～100:50～500:1000。具体的，所述的Fe3O4纳米磁珠经过预处理后与利托菌素混合，Fe3O4纳米磁珠的预处理过程为：将聚丙烯酸分散在MES溶液中，再加入活化剂，在室温下搅拌10～30min，得到活化后的聚丙烯酸溶液；将表面经过硅烷化处理的Fe3O4纳米磁珠加入到乙醇和水的混合液中，室温下搅拌5～10min；然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶液，继续在室温下搅拌反应6～12h，洗涤，得到初步预处理的Fe3O4纳米磁珠；将初步预处理的Fe3O4纳米磁珠加入MES溶液中搅拌均匀，再加入活化后的聚丙烯酸溶液，室温下搅拌反应0.5～6h，洗涤，得到预处理后的Fe3O4纳米磁珠。具体的，所述的活化剂由HNS溶液和EDC溶液混合而成，聚丙烯酸、EDC与HNS按照物质的量为35～210:4:1的比例混合，其中，聚丙烯酸的平均分子量为2000～45000；所述的Fe3O4纳米磁珠的质量与3-氨基丙基三乙氧基硅烷的体积比为1:0.5～25；所述的Fe3O4纳米磁珠的质量与聚丙烯酸的体积比为0.1～5:1，其中质量单位为g，体积单位为m；具体的，Fe3O4纳米磁珠与利托菌素的质量比为1:1～5；所述的Fe3O4纳米磁珠与利托菌素溶液混合后搅拌过程为：在室温下先以200～800rpm搅拌2～3h后，再调整搅拌速度为50～200rpm搅拌6～24h。本专利技术还公开了上述利托菌素磁珠用于吸附肺炎球菌的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术制备的利托菌素磁珠对肺炎球菌具有特异性，在吸附过程中能够与肺炎球菌细胞壁结合，具有准确性高、操作简便和特异性强等优势，能够从较为复杂、细菌含量极低的样品中快速分离富集肺炎球菌，提高了肺炎球菌的检测效率和阳性率。(2)本专利技术通过L-精氨酸修饰利托菌素，降低了利托菌素与磁珠表面羧基结合的空间位阻，然后通过聚丙烯酸修饰磁珠，增大了磁珠的比表面积，最后将L-精氨酸修饰的利托菌素修饰到聚丙烯酸磁珠表面，从而得到了一种能够快速富集样品中痕量细菌的功能性磁珠。附图说明图1是实施例1制备的利托菌素磁珠TEM图。图2是利托菌素磁珠吸附肺炎球菌TEM图。图3是利托菌素磁珠吸附肺炎球菌后的环介导等温扩增结果。图4是加入2,2,2-三氯乙醇和不加入2,2,2-三氯乙醇的磁珠的粒径和吸附效率。图5是不同浓度的L-精氨酸、丝氨酸和半胱氨酸修饰利托菌素对磁珠吸附效率的影响。图6是不同用量的活化剂对磁珠粒径以及吸附效率的影响。图7是本专利技术制备的利托菌素磁珠对肺炎球菌检测灵敏度和特异性的验证结果图，(A)为肺炎球菌检测灵敏度，(B)为肺炎球菌特异性验证。以下结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术做具体说明。具体实施方式利托菌素(Ristocetin)是一种糖肽类抗生素，可以与利托菌素细菌胞壁快速结合，抑制其细胞壁的合成。同时，利托菌素在细胞壁上的结合位点较为偏僻，不易于其他化合物形成竞争，有利于利托菌素发挥抗菌作用。磁性纳米材料由于具有较好的生物相容性和磁响应性，可以修饰各种表面活性基团，而被广泛用于微生物或其他物质的检测。本专利技术通过将利托菌素修饰到磁性纳米材料的表面获得了一种能够快速富集样品中痕量肺炎球菌的功能性磁珠，提高了样品检测结果的阳性率。本专利技术制备了一种利托菌素磁珠，该磁珠包括核心Fe3O4纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利托菌素磁珠，其特征在于，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的利托菌素。

【技术特征摘要】
1.一种利托菌素磁珠，其特征在于，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的利托菌素。2.一种利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，包括：将Fe3O4纳米磁珠与利托菌素溶液混合后在室温下搅拌8～27h，得到表面包覆利托菌素的Fe3O4纳米磁珠，即利托菌素磁珠。3.如权利要求2所述的利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，所述的利托菌素经过预处理后与Fe3O4纳米磁珠混合，利托菌素的预处理过程为：将利托菌素和2,2,2-三氯乙醇共同混合在二氯甲烷溶液中，再加入催化剂和吸水剂，室温下搅拌0.5～4h；然后蒸发去除溶液中的二氯甲烷，得到初步预处理的利托菌素；将L-精氨酸溶于MES溶液中，再加入活化剂，室温下搅拌10～30min，得到活化后L-精氨酸溶液；将活化后L-精氨酸溶液加入到初次处理的利托菌素溶液中，室温下搅拌0.5～6h，得到预处理后的利托菌素溶液。4.如权利要求3所述的利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，所述的利托菌素和2,2,2-三氯乙醇的质量比为4～33:1；所述的L-精氨酸与利托菌素的质量比为1：5～10。5.如权利要求4所述的利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，所述的活化剂由EDC溶液和HNS溶液混合而成，所述的L-精氨酸、EDC和HNS按照物质的量为5:4:1的比例混合。6.如权利要求3所述的利托菌素磁珠的制备方法，其特征在于，所述的催化剂为4-二甲氨基吡啶、硼酸、三乙基苄基氯化铵、对甲苯磺酸、硫酸铜或氧化锌；所述的吸水剂为二环己基碳二亚胺、醋酸酐、醋酸钠、五氧化二磷或硫酸钠；所述的催化剂、吸水剂和利托菌素的物质的量的比例为1～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔浪军，申萧蒙，陈蓓，陈雪，黄自华，冯润东，王莉芳，张鹏，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61