一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用技术

本公开涉及一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用，通过滚环扩增技术合成了长单链DNA，与富含G和C的DNA单链(loading链)互补杂交得到单双链交替的DNA分子聚集体，可负载大量的Dox。当体系的pH降低时，滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链，并且释放出嵌插的Dox，从而完成药物释放。可通过调节pH实现Dox的可逆嵌插和释放。该方法利用生物相容性良好的DNA纳米结构作为药物载体，提高载药量，具有成本低廉、操作简便、对pH响应灵敏度高、反应快速等优点。

A pH-induced drug-sustained-release DNA nanostructure and its preparation and Application

The present disclosure relates to a pH-induced drug-sustained-release DNA nanostructure and its preparation method and application. Long single-stranded DNA is synthesized by rolling ring amplification technology, and single-stranded and double-stranded alternating DNA molecular aggregates are obtained by complementary hybridization with G and C-rich DNA single-strands (loading chains), which can load a large number of Dox. When the pH of the system decreases, the products fold to form a triple helix configuration. DNA aggregates are double-stranded, releasing single strands of DNA rich in G and C, and releasing embedded DNA oxides to complete drug release. Reversible insertion and release of Dox can be achieved by adjusting pH. This method uses DNA nanostructures with good biocompatibility as drug carriers to increase drug loading. It has the advantages of low cost, simple operation, high sensitivity to pH and fast reaction.

【技术实现步骤摘要】
一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用
本公开涉及一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构及其制备方法与应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。化学药物治疗是目前治疗癌症的主要方法，然而化疗药物会随着血液循环遍布全身的绝大部分组织和器官。因此，化疗的缺点之一，即为抗癌药物在进攻肿瘤细胞的同时，也会对非病变的正常细胞产生影响并导致严重的副作用。例如，阿霉素(doxorubicin,Dox)是一种广泛用于癌症化疗的蒽环类药物，但可诱发心肌病，导致充血性心力衰竭。目前针对于癌症的治疗，亟待开发靶向给药系统以减小抗癌药物的副作用。pH对于生物体的正常运行起着至关重要的作用，是参与人体各种生物途径的必需调节剂。pH的改变会引起细胞功能紊乱，并诱发各种疾病。而肿瘤细胞在生长过程中生成更多的乳酸等酸性代谢产物，使肿瘤组织周边组织液的pH降低。因此，肿瘤周围微环境的pH通常情况下要低于正常组织和器官的pH，利用这一特性对提高肿瘤诊断和治疗效果具有重要意义。
技术实现思路
针对
技术介绍
，本公开提供一种pH诱导DNA纳米结构构型变化缓释抗癌药物的制备方法及应用。本公开具体采用以下技术方案：在本公开的第一个方面，提供一种pH诱导药物缓释的DNA纳米结构的制备方法，该方法包括以下步骤：通过滚环扩增反应合成长单链DNA；与另外的富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)碱基互补配对结合得到单双链交替的DNA分子聚集体。其中，所述DNA分子聚集体的双链部分含有能够负载抗癌药物的位点；当pH降低时，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放游离的富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)，并释放出嵌插的药物。在本公开的第二个方面，提供采用上述方法制备得到的pH诱导的药物缓释DNA纳米结构。在本公开的第三个方面，提供采用上述方法制备得到的pH诱导的抗癌药物释放体系。在本公开的第四个方面，提供所述pH诱导的药物缓释DNA纳米结构在制备缓释抗癌药物载体中的应用。在本公开的第五个方面，提供所述pH诱导的药物缓释DNA纳米结构在制备缓释抗癌药物中的应用。在本公开的第六个方面，提供所述pH诱导的抗癌药物释放体系在抗癌药物缓释中的应用。在本公开的第七个方面，提供一种pH诱导的缓释抗癌药物阿霉素，该缓释抗癌药物阿霉素是通过以下步骤制备得到的：制备环状DNA模板：首先将引物链(primer链)和5'端修饰磷酸基团的锁式探针(template链)在1×T4DNA连接酶缓冲液中一起退火；然后向杂交后的DNA溶液中加入T4DNA连接酶，反应后得到环状DNA模板，加热使T4DNA连接酶失活；滚环扩增合成长单链DNA：向1×DNA聚合酶缓冲液中加入制备的环状DNA模板溶液、phi29DNA聚合酶溶液、dNTPs溶液，孵育，得到大量的长单链DNA，然后加热使phi29DNA聚合酶失活；制备单双链交替的DNA分子聚集体：向长单链DNA溶液中加入负载链DNA，孵育；制备负载抗癌药物阿霉素的DNA分子聚集体：向制备的单双链交替的DNA分子聚集体溶液中加入阿霉素，孵育，即得到负载抗癌药物Dox的DNA纳米结构。在本公开的第八个方面，提供一种pH诱导的抗癌药物阿霉素的缓释方法，实现抗癌药物阿霉素缓释的方法主要包括以下步骤：pH诱导抗癌药物阿霉素的缓释：加酸使负载抗癌药物阿霉素的DNA分子聚集体溶液的pH值降低，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)，并释放出嵌插的药物。与本专利技术人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：本公开通过滚环扩增放大技术合成了长单链DNA，与另外的富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)碱基互补配对结合得到单双链交替的DNA分子聚集体，其可以负载大量的抗癌药物(如：阿霉素可扦插到DNA双链结构中的5′-GC-3′或5′-CG-3′碱基对中)。通过调节pH实现抗癌药物阿霉素在DNA双链结构5′-GC-3′或5′-CG-3′碱基对中的可逆嵌插和释放。当pH降低时，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)，并释放出嵌插的药物。该方法利用生物相容性良好的DNA纳米结构作为药物载体，提高载药量，具有成本低廉、操作简便、对pH响应灵敏度高、反应快速等优点。该体系成功应用于基于pH控制的抗癌药物缓释体系，有望成为针对肿瘤细胞的一种靶向给药系统。附图说明构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。图1：pH诱导DNA构型变化释放抗癌药物原理图。图2：电泳表征DNA分子聚集体的形成；泳道1：loading链；泳道2：primer链；泳道3：template链；泳道4：primer链和template链退火杂交；泳道5：primer链和template链退火杂交后加入T4DNA连接酶连接；泳道6：滚环扩增合成的长单链DNA；泳道7：DNA分子聚集体。图3：不同浓度阿霉素嵌插到DNA分子聚集体后的荧光强度以探究最适载药量。图4：不同pH下DNA分子聚集体中阿霉素的荧光光谱图。图5：阿霉素在DNA分子聚集体中可逆负载-释放的情况。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语包含和/或包括时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。本公开利用抗癌药物(阿霉素)可嵌插至DNA双链结构的5′-GC-3′或5′-CG-3′碱基对中，而在pH诱导下引发DNA构型变化释放抗癌药物的特性，成功构建了基于pH值控制的抗癌药物缓释体系，有望成为针对肿瘤的一种靶向给药系统。在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构的制备方法，该方法包括以下步骤：通过滚环扩增反应合成长单链DNA；与另外的富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)碱基互补配对结合得到单双链交替的DNA分子聚集体，即为pH诱导的药物缓释DNA纳米结构；其中，所述DNA分子聚集体的双链部分含有能够负载药物的位点；当pH降低时，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链(负载链或loading链)，并释放嵌插的药物。在本公开的一个或一些的实施方式中，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补，称为引物链或primer链)，在phi29DNA聚合酶和dNTPs作用下，形成长单链DNA，此长单链DNA包含成百上千个重复的环状DNA模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：通过滚环扩增反应合成长单链DNA；与另外的富含G和C的DNA单链互补杂交得到单双链交替的DNA分子聚集体，即为pH诱导的药物缓释DNA纳米结构；其中，所述DNA分子聚集体的双链部分含有能够负载抗癌药物的位点；当pH降低时，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链，并释放出嵌插的药物。

【技术特征摘要】
1.一种pH诱导的药物缓释DNA纳米结构的制备方法，其特征是，该方法包括以下步骤：通过滚环扩增反应合成长单链DNA；与另外的富含G和C的DNA单链互补杂交得到单双链交替的DNA分子聚集体，即为pH诱导的药物缓释DNA纳米结构；其中，所述DNA分子聚集体的双链部分含有能够负载抗癌药物的位点；当pH降低时，引发滚环扩增产物折叠形成三螺旋构型，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链，并释放出嵌插的药物。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，以环状DNA为模板，primer链为引物，在DNA聚合酶催化下将dNTPs转变成长单链DNA；进一步的，加入phi29DNA聚合酶和dNTPs之后，以环状DNA为模板形成长单链DNA。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，template链是一条5'端修饰磷酸基团的DNA单链，其5'端和3'端分别有数个碱基与primer链互补，在与primer链一起退火并逐渐降温后，template链与primer链杂交环化，在T4DNA连接酶和ATP的作用下，template链5'端的磷酸基团和3'端的羟基形成磷酸二酯键，形成滚环扩增的环状DNA模板，其中，环状DNA包括三螺旋结构的互补序列；进一步的，template链是一条5'端修饰磷酸基团的长为81个碱基的DNA单链，其5'端和3'端分别有14和15个碱基与primer链互补，在与primer链一起退火并逐渐降温至25℃后，template链与primer链杂交环化，在T4DNA连接酶和ATP的作用下，template链5'端的磷酸基团和3'端的羟基形成磷酸二酯键，从而形成滚环扩增的环状DNA模板；更进一步的，所述template链的序列为：5'-CCCTACCACGGACTAAAAAAGAGAAGAAAAAGAAGAGCTCGTCGTCGTCGTCGTCTCTTCAAAAAAAGTCACCCCAACCTG-3'；进一步的，所述primer链的序列为：5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是，富含G和C的DNA单链的序列为5'-CTCGTCGTCGTCGTCGT-3'；所述抗癌药物为阿霉素，结合位点为5'-GC-3'和5'-CG-3'碱基对。5.采用权利要求1～4中任一项所述的方法制备得到的pH诱导的药物缓释DNA纳米结构，其特征是，所述DNA纳米结构为单双链交替的DNA分子聚集体，中性条件下，单双链交替的DNA分子聚集体保持不变，酸性条件下，滚环扩增产物折叠形成若干个三螺旋构型DNA，DNA分子聚集体双链解链，释放富含G和C的DNA单链；或者，所述DNA纳米结构包括若干个三螺旋构型的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕赛，李园芳，岳淑珍，潘思羽，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37