植物抗旱、耐盐蛋白AsCIPK14及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，具体涉及植物抗旱耐盐蛋白AsCIPK14及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因能够改良、增强小麦抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，并且有效节省水资源。

Plant Drought and Salt Tolerance Protein AsCIPK14 and Its Coding Genes and Applications

The invention belongs to the field of agricultural biotechnology, in particular to plant drought and salt tolerance protein AsCIPK14 and its coding gene and application. The amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID No.1 and the gene sequence is shown in SEQ ID No.2. The drought resistance, salt tolerance related protein and its coding gene of the invention can improve and enhance the stress resistance of wheat, increase yield, accelerate the process of stress resistance molecular breeding, and effectively save water resources.

【技术实现步骤摘要】
植物抗旱、耐盐蛋白AsCIPK14及其编码基因和应用
本专利技术属于农业生物
，具体涉及植物抗旱耐盐蛋白AsCIPK14及其编码基因和应用。
技术介绍
小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，根据基因序列的相似性和基因结构的不同，分为SnRK1，SnRK2和SnRK3三个亚家族。SnRK蛋白激酶三个亚家族都有相似的结构特点，N-端均具有一段能与其他蛋白相互作用的激酶结构域，此结构域含有一个保守的苏氨酸，三个亚家族中的其他结构高度变化。其中，SnRK3是植物特有的一类蛋白激酶，又被称为类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurinB-likecalciumsesor-interactingproteinkinases，CIPK)。CIPK是一类Ser/Thr蛋白激酶，其包括N端激酶区、C端调控区，还包括一个由21个氨基酸组成的FISL/NAF元件。目前，在拟南芥和水稻中已分别发现25、30个CIPK家族成员。其中，N端激酶区氨基酸序列一致性在51％-90％之间。而在C端调控区这两者之间的氨基酸序列一致性在24％-58％之间，表现出高度的可变性。拟南芥中CIPK9作为一个关键的调节因子使植物体适应低钾环境，CIPK9受非生物胁迫的调控,并且它的转录表达在植物的根部和幼苗中受钾离子缺乏的诱导。拟南芥中的AtCIPK14基因的表达受糖代谢的诱导,但不受甘露醇的诱导，证明这个基因不受渗透胁迫的诱导。水稻中克隆的OsCIPK基因都参与了各种不同的非生物胁迫的转录水平反应。水稻中的20个OsCIPK基因至少被干旱、高盐、冷、PEG和ABA处理胁迫所诱导。OsCIPK3、OsCIPK12和OsCIPK15基因过表达提高水稻对冷、干旱和高盐胁迫等方面的抗逆性，转OsCIPK12和OsCIPK15基因的植株在处于胁迫状态下的脯氨酸和可溶性糖的积累比对照明显提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14。本专利技术的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本专利技术的再一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关基因AsCIPK14的应用。本专利技术的再一目的是提供一种提高植物抗旱、耐盐性的方法。本专利技术所提供的抗旱耐盐蛋白AsCIPK14，来源于燕麦，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示：本专利技术的AsCIPK14蛋白的编码基因具有如SEQIDNo.2所示cDNA序列：根据本专利技术具体实施方式的重组表达载体，其包括双元农杆菌载体、可用于植物微弹轰击的载体，还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。使用基因AsCIPK14构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。本专利技术的再一目的是提供提高植物抗旱耐盐的方法，此方法中将AsCIPK14基因导入植物细胞中。将本专利技术所提供的SnRK蛋白激酶AsCIPK14基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、燕麦、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本专利技术以燕麦为实验材料，得到抗旱、耐盐相关的AsCIPK14蛋白及其编码基因。将AsCIPK14基因导入小麦，显著提高了小麦的抗旱、耐盐性。本专利技术的抗旱相关蛋白及其编码基因能够改良、增强小麦抗逆性、提高产量、加速抗逆分子育种进程、有效节省水资源。附图说明图1显示T1代转基因小麦PCR检测结果，M：Trans2KPlusDNAmarker；1：阴性对照；2-10为转基因小麦株系。图2显示AsCIPK14转基因小麦耐旱性鉴定情况；CK为野生型；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7为不同转基因小麦株系；图3为AsCIPK14转基因小麦耐盐性鉴定情况，CK为野生型；L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7为不同转基因小麦株系。具体实施方式实施例1克隆燕麦AsCIPK14基因的cDNA对生长10天左右的燕麦(AvenasativaL.)幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取燕麦总RNA。利用5’RACE试剂盒和3’RACE试剂盒获得AsCIPK14基因，其序列全长为1362bp。用Trizol提取燕麦幼苗的总RNA，用superscriptII反转录酶反转录获得到cDNA。设计引物P1和P2，以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGAGAGCAGAGGGAAGAT-3’，P2：5’-CTAGTAACGGCCGCCAGTGTGC-3’。对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.3kb左右的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-TEasy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的AsCIPK14基因的开放阅读框(ORF)为SEQIDNo.2的自5’末端第1至1362位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质。将含序列SEQIDNo.2所示AsCIPK14基因的重组载体命名为pTE-AsCIPK14。AsCIPK14基因的序列在Genbank上进行比对，在燕麦中未发现同源蛋白基因，证明AsCIPK14基因是一个新的基因。进一步用引物P1和P2在燕麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。实施例2验证AsCIPK14基因增强植物的抗旱、耐盐性1.构建Ubi-AsCIPK14本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物抗旱、耐盐相关基因AsCIPK14，其特征在于，其编码植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14，所述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.植物抗旱、耐盐相关基因AsCIPK14，其特征在于，其编码植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14，所述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因AsCIPK14，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.植物抗旱、耐盐相关蛋白AsCIPK14，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。4.包含权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关基因AsCIP...

【专利技术属性】
技术研发人员：高世庆，赵昌平，廖祥正，张风廷，李根英，杨涛，公杰，刘永杰，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11