西罗莫司产生菌的育种方法技术

本发明专利技术提供西罗莫司产生菌的育种方法，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。采用本发明专利技术方法对西罗莫司产生菌进行选育，所得菌株的抗剪切力和西罗莫司生产能力均有所提高，最终提高了发酵液中西罗莫司的产量。

Breeding methods of sirolimus-producing bacteria

The invention provides a breeding method of sirolimus producing bacteria. The sirolimus producing bacteria are inserted into a culture bottle containing glass slag, and the culture bottle is placed in a shaking table to shake. After shaking, the bacteria liquid is diluted and coated on a flat plate to pick up a single colony, that is, the strain with improved shear resistance and sirolimus production capacity. The method of the invention is used to select the sirolimus producing bacteria, and the shear resistance of the obtained strain and the production capacity of the sirolimus are improved, and finally the production of the sirolimus in the fermentation broth is increased.

【技术实现步骤摘要】
西罗莫司产生菌的育种方法
本专利技术涉及微生物育种技术，具体地说，涉及西罗莫司产生菌的育种方法。
技术介绍
西罗莫司(Rapamycin)是由吸水链霉菌发酵生产的一种大环内酯类化合物，它具有抗真菌、免疫抑制、抗肿瘤、神经保护和抗衰老等活性，临床上被应用于器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。西罗莫司是一种具有多种生物活性、有价值的天然产物，但是野生型西罗莫司生产菌种较低的西罗莫司产量却是限制其工业化生产和应用的一个重要因素。因此，提高西罗莫司发酵水平势在必行。微生物菌株的发酵能力不仅取决于菌体本身的性能，生长环境适宜也是菌体高效表达产物的必要因素。发酵工业中，深层通氧搅拌发酵起着重要作用，其目的是使体系气液两相充分接触，强化过程的混合和传质，促进系统内培养基组分，温度、pH值和溶解氧等均匀分布，保证菌体能在良好的环境中正常生长和代谢等。但它也有不利方面，高速旋转的搅拌器剪切生产菌丝，易造成细胞损伤；搅拌转速变慢后，溶氧供应不足，发酵单位增长缓慢。搅拌最终与发酵生产能力和产品质量息息相关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供西罗莫司产生菌的育种方法，以提高菌株的抗剪切力和西罗莫司生产能力。本专利技术构思如下：通过对种子瓶内西罗莫司产生菌的菌丝用玻璃渣进行抗剪切力筛选，获得菌丝细胞可以耐受强压力的菌株，以提高菌株在发酵罐中对剪切力的适应性，减少细胞的损伤，最终提高西罗莫司的生产能力。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供西罗莫司产生菌的育种方法，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。进一步地，将西罗莫司产生菌的斜面挖菌块接入种子瓶培养，培养结束后将培养成熟的菌丝接入装有玻璃渣的培养瓶内，然后将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。本专利技术中，所述西罗莫司产生菌包括但不限于吸水链霉菌(Streptomyceshygroscpicus)，如菌株FC904-25。前述的方法，摇床培养条件为：26-30℃，260-300rpm培养30-60min，优选28℃，300rpm培养60min。优选地，所述玻璃渣的形状为三角形，面积为0.1-0.2cm2。本专利技术的西罗莫司产生菌育种方法，具体包括以下步骤：A、斜面和种子培养：将西罗莫司产生菌传斜面，培养温度26-30℃，培养5-6天；B、将斜面菌块接入装有液体培养基的种子瓶中，26-30℃，摇床转速250-280rpm，种子瓶装液量100ml/750ml，培养45-55h；C、取1ml步骤B的菌液于装有9ml生理盐水和12-15g玻璃渣的三角瓶中，26-30℃，260-300rpm摇床振摇30-60min；D、振摇结束后，所得菌液经梯度稀释后涂平板，分离得单菌落。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述方法如下：a、将吸水链霉菌传斜面，培养温度28℃，培养5天；b、将斜面菌块接入装有液体培养基的种子瓶中，28℃，摇床转速260rpm，种子瓶装液量100ml/750ml，培养48h；c、取1ml步骤b的菌液于装有9ml生理盐水和15g玻璃渣的三角瓶中，28℃，300rpm摇床振摇60min；d、振摇结束后，所得菌液经梯度稀释后涂平板，分离得单菌落。步骤B所述液体培养基为：葡萄糖18-22g/L，磷酸氢二钾05-1.5g/L，豆粕粉19-23g/L和硫酸铵1.5-2.5g/L(以水配制)。优选地，所述液体培养基为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾1g/L，豆粕粉21g/L和硫酸铵2g/L。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：采用本专利技术方法对西罗莫司产生菌进行选育，所得菌株的抗剪切力和西罗莫司生产能力均有所提高，最终提高了发酵液中西罗莫司的产量。西罗莫司产生菌在发酵生产中需要较高的搅拌转速以满足生产过程中对溶氧等的需求，但由于其是丝状菌发酵，过强的剪切力易致生产菌菌丝体受到机械损伤、生理状态异常、抑制菌体生长，而经过抗剪切力育种的西罗莫司产生菌在生产中能够耐受一定的剪切力，这样就可以提高搅拌转速强化过程中营养物质的混合及传质，促进系统内培养基组分，温度、pH值和溶解氧等均匀分布，保证菌体能在良好的环境中正常生长和代谢，最终提高发酵单位。经过抗剪切力育种的西罗莫司产生菌在生产上平均发酵单位可提高68.7％左右。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例1-3中使用的吸水链霉菌为菌株FC904-25。实施例4-6中使用的吸水链霉菌为菌株WY93。所用玻璃渣为自制：将玻璃试管(管壁厚0.15cm)敲碎选择面积在0.1-0.2cm2的三角形。实施例1西罗莫司产生菌的育种方法1、斜面和种子培养：用吸水链霉菌传斜面，培养温度28℃，培养5天。将成熟斜面菌块接入种子瓶培养(含有种子培养基)，28℃，摇床转速260rpm，摇瓶装液量100ml/750ml，培养48h后菌浓38％(体积法测定)，吸取1ml菌液于装有9ml生理盐水和15g玻璃渣的三角瓶中(同时以未加入玻璃渣，仅装有9ml生理盐水的三角瓶作为对照组)，将三角瓶置于摇床上，28℃，300rpm振摇30min，梯度稀释分离得单菌落，与对照组相比，实验组致死率仅为37％。致死率＝(对照组每毫升单菌落数-实验组每毫升单菌落数)/对照组每毫升单菌落数×100培养成熟后将实验组、对照组分别挑取单菌落，传接斜面，接种子瓶。所用种子培养基为：葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾1g/L，豆粕粉21g/L和硫酸铵2g/L(以水配制)。发酵培养：将成熟种子液接入发酵瓶培养。向发酵瓶培养基中分别加入1颗、2颗、3颗直径3mm的玻璃珠。种子液的接种量2ml/20ml，28℃，摇床转速260rpm，摇瓶装液量20ml/250ml，发酵192h后用HPLC测定发酵液中西罗莫司的效价。所用发酵培养基为：葡萄糖60g/L，磷酸氢二钾1g/L，棉籽饼粉21g/L，氯化钠5g/L，L-赖氨酸盐酸盐15g/L(以水配制)。发酵结束后，测得实验组(用玻璃渣上摇床振摇30min)分离得到的单菌落与对照组相比，效价普遍提高16％左右。实施例2西罗莫司产生菌的育种方法种子瓶培养好后吸取1ml菌液于装有9ml生理盐水和15g玻璃渣的三角瓶中，上摇床振摇45min，其余操作同实施例1，梯度稀释分离得单菌落，与对照组相比，实验组致死率在49％。发酵结束后，测得实验组(用玻璃渣上摇床振摇45min)分离得到的单菌落与对照组相比，效价普遍提高38％左右。实施例3西罗莫司产生菌的育种方法种子瓶培养好后吸取1ml菌液于装有9ml生理盐水和15g玻璃渣的三角瓶中，上摇床振摇60min，其余操作同实施例1。梯度稀释分离得单菌落，与对照组相比，实验组致死率在61％。发酵结束后，测得实验组(用玻璃渣上摇床振摇60min)分离得到的单菌落与对照组相比，效价普遍提高51％左右。以往发酵罐转速最大只能达到150rpm，如果进一步提高转速，会导致料液转稀。采用抗剪切力的菌种后转速可以提高到250rpm，这样可以促进营养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.西罗莫司产生菌的育种方法，其特征在于，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。

【技术特征摘要】
1.西罗莫司产生菌的育种方法，其特征在于，将西罗莫司产生菌接入装有玻璃渣的培养瓶内，将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将西罗莫司产生菌的斜面挖菌块接入种子瓶培养，培养结束后将培养成熟的菌丝接入装有玻璃渣的培养瓶内，然后将培养瓶置于摇床振摇，振摇结束后，菌液稀释后涂平板，挑取单菌落，即为抗剪切力和西罗莫司生产能力提高的菌株。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述西罗莫司产生菌包括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscpicus)。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，摇床振摇条件为：26-30℃，260-300rpm振摇30-60min，优选28℃，300rpm振摇60min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玻璃渣的形状为三角形，面积为0.1-0.2cm2。6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、斜面和种子培养：将西罗莫司产生菌传斜面，培养温度26-30℃，培养5-6天；B、将斜面菌块接入装有液体培养基的种子瓶中，26-30℃，摇床转速250-280rp...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛艳霞，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11