The present disclosure provides a construct comprising a first fusion protein, a second fusion protein and a ligand, wherein the first fusion protein and the second fusion protein respectively contain affinity reagents and active enzymes, and the ligand comprises first and second functional groups that are specific for irreversibly inhibiting the first and second fusion protein active enzymes. The present disclosure also provides a method for (a) contacting a first fusion protein comprising affinity reagents and active enzymes with a ligand comprising functional groups specific to irreversibly inhibiting the first fusion protein active enzymes, thereby coupling the first fusion protein with the ligand, and (b) a second fusion protein comprising affinity reagents and active enzymes. Contact with the connector includes functional groups that are specific to irreversibly inhibit the second fusion protein active enzyme, thereby coupling the second fusion protein with the connector.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】融合蛋白构建体
本公开一般涉及融合蛋白构建体及其制备和使用方法。更具体地，本公开涉及精确限定的融合蛋白构建体，其包含通过模块合成制备的并且通过连接体偶联的至少第一融合蛋白和第二融合蛋白。
技术介绍
生物药物，特别是单克隆抗体(mAb)和包含抗体片段的药物在制药工业中很受关注，因为其具有特异性靶向循环中或细胞表面的疾病相关蛋白的能力。下一代抗体疗法，即那些显示出增强的治疗潜力的抗体疗法，已经通过增加抗体效价、附着增加细胞毒性和半衰期的效应分子以及使用引导免疫系统清除目标的方式来产生。然而，这些分子通常难以高产率地且具有合成灵活性的生产，使得期望的功能被系统优化。例如，具有扩展功能的当前抗体格式必须针对稳定性或功能进行费力地优化，因为它们具有必须同时表达的多个域。目前的化学方法需要反应性氨基酸工程或使用预先存在的反应性氨基酸侧链将有效负载附接到抗体支架上。在许多情况下，这些反应的产物产生产品的异质群体。这种直接氨基酸修饰也可能不稳定或对母体分子的药理学性质造成有害影响(例如增加的疏水性、聚集性、免疫原性等)。因此，必须花大量的精力来选择合适的位置来连接有效载荷。此外，...
【技术保护点】
1.一种构建体，其包含：第一融合蛋白、第二融合蛋白，和连接体，其中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶；并且所述连接体包含在第一末端对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团，和在第二末端对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的第二官能团。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.06 US 62/346,3691.一种构建体，其包含：第一融合蛋白、第二融合蛋白，和连接体，其中，所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白各自包含亲和试剂和活性酶；并且所述连接体包含在第一末端对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的第一官能团，和在第二末端对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的第二官能团。2.根据权利要求1所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。3.根据权利要求1所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。5.根据权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。6.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体，其中每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。7.根据权利要求6所述的构建体，其中所述亲和试剂为抗体或其片段。8.根据权利要求7所述的构建体，其中所述抗体或其片段选自由轻链可变结构域(VL)、轻链恒定结构域(CL)、重链可变结构域(VH)、重链恒定结构域(CH1)及其组合组成的群组。9.根据权利要求7或权利要求8所述的构建体，其中所述第一融合蛋白抗体或其片段是嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。10.根据权利要求7至9中任一项所述的构建体，其中所述抗体或其片段包含曲妥珠单抗或其片段。11.根据权利要求7至10中任一项所述的构建体，其中所述抗体或其片段选自由阿达木单抗、阿仑单抗、阿西莫单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗、英西单抗、卡罗单抗、英夫利昔单抗、阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、若莫单抗(nofetumomab)、奥马珠单抗、达利珠单抗、替伊莫单抗、莫罗单抗、依决洛单抗、吉姆单抗奥佐米星、戈利木单抗、赛妥珠单抗、依库珠单抗、优斯它单抗、帕尼单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、瑞西巴库单抗、托珠单抗、本妥昔单抗、奥法木单抗、贝利木单抗、雷莫卢单抗、维多珠单抗、奥比妥珠单抗、培布利珠单抗、雷尼珠单抗、帕妥珠单抗、狄诺塞麦单抗、卡妥索单抗、戈利木单抗、司妥昔单抗、那他珠单抗、帕尼单抗和狄诺塞麦单抗组成的群组。12.根据权利要求6所述的构建体，其中所述亲和试剂为小分子。13.根据权利要求12所述的构建体，其中所述小分子为药物。14.根据权利要求13所述的构建体，其中所述小分子选自由阿地白介素、阿仑膦酸、苜蓿酮(alfaferone)、阿利维A酸、别嘌呤醇、别嘌醇钠、阿洛西、六甲蜜胺、氨鲁米特、左旋天冬酰胺酶、氨磷汀、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、安泽梅特(anzmet)、安然爱斯普、阿格拉宾、三氧化二砷、阿诺新、5-氮杂胞苷、咪唑硫嘌呤、卡介苗或泰斯-卡介苗(tice-BCG)、苯丁抑制素、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、贝沙罗汀、硫酸博莱霉素、溴尿苷、硼替佐米、博莱霉素、白消安、降血钙素、坎帕斯(campath)、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、卡索地司、头孢烯酮(cefesone)、西莫白介素、柔红比星、苯丁酸氮芥、顺铂、左旋门冬酰胺酶、克拉屈滨、氯甲双磷酸、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、地塞米松、地塞米松磷酸盐、去雌激素(delestrogen)、地尼白介素-毒素连接体(denileukindiftitox)、德博美德罗(depomedrol)、地洛瑞林、右丙亚胺、道诺霉素、二乙基己烯雌酚，2′，2′-二氟脱氧胞苷、大扶康、多西他奇、脱氧氟尿苷、阿霉素、屈大麻酚、DW-166HC、艾加尔德(eligard)、埃立特克(elitek)、埃伦斯(ellence)、埃漫德(emend)、表阿霉素、促红细胞生成素α、红细胞生成素针剂(epogen)、依铂、盐酸左旋米唑和5-氟尿嘧啶制剂(ergamisol)、雌二醇制剂(estrace)、雌二醇、雌氮芥(estramustine)磷酸钠、炔雌醇、氨磷汀、羟基磷酸、凡毕复(etopophos)、依托泊苷、法倔唑、法斯通(farstone)、非格司亭、非那司提、弗拉格汀(fligrastim)、氟尿苷、氟康唑、氟达拉宾(fludarabin)、氟达拉宾磷酸盐、5-氟脱氧尿苷、5-氟脱氧尿苷单磷酸酯、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟羟甲基睾丸素、氟他胺、六甲基三聚氰胺、福美坦、福司他滨(fosteabine)、福莫司汀、氟维司群、伽玛伽(gammagard)、吉西他滨、吉姆单抗、格列卫、卡氮芥糯米纸胶囊剂(gliadel)、戈舍瑞林、盐酸格拉司琼、组氨瑞林、托泊替康、氢化可通、赤羟腺嘌呤(erythro-hydroxynonyladenine)、羟基脲、己酸羟孕酮、替伊莫单抗、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺、干扰素-α、干扰素-α-2、干扰素-α-2α、干扰素-α-2β、干扰素-α-n1、干扰素-α-n3、干扰素-β、干扰素-γ-1α、白细胞介素-2、基因内区A、易瑞沙、依立替康、凯特瑞、香菇多糖硫酸盐、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、亮丙瑞林醋酸盐、左旋咪唑、左亚叶酸钙盐、左甲状腺素钠、左甲状腺素钠制剂(levoxyl)、环己亚硝脲、氯尼达明、屈大麻酚、二氯甲基二乙胺、甲钴胺、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、左旋溶肉瘤素、梅尼斯特(menest)、6-巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、美特维克、米替福新、二甲胺四环素、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、莫多纳(modrenal)、阿霉素脂质体(myocet)、奈达铂、纽拉斯塔(neulasta)、纽米伽(neumega)、纽普根(neupogen)、尼鲁米特(nilutamide)、诺瓦得士(nolvadex)、NSC-631570、OCT-43、奥曲肽、盐酸奥坦西隆、奥拉普雷德(orapred)、奥沙利铂、紫杉醇(paclitaxel)、泼尼松磷酸钠制剂(pediapred)、培门冬酶、聚乙二醇干扰素、喷司他汀、N-膦酰基乙酰天门冬氨酸(PALA)、溶链菌、盐酸毛果芸香碱、吡柔比星、光神霉素、卟吩姆钠、松龙苯芥、脱氢皮质(甾)醇、强的松、普雷马林、甲基苄肼、普罗克瑞(procrit)、雷替曲塞、利比、铼-186依替膦酸盐、利妥昔单抗、罗扰素-A、罗莫肽、盐酸毛果芸香碱(salagen)、善宁、沙莫司亭、甲基环己亚硝脲、西佐喃、索布佐生、甲基强的松龙溶胶、链佐星、氯化锶-89、左甲状腺素钠、它莫西芬、坦索洛新、他索纳明、睾内酯(tastolactone)、泰索帝(taxoter)、替西白介素、替莫唑胺、替尼泊苷、丙酸睾酮、甲睾酮(testred)、硫鸟嘌呤、噻替派、促甲状腺素、替鲁膦酸、托泊替康、托瑞米芬(toremifen)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、托消安(teosulfan)、维生素A酸、甲氨蝶呤、三甲基三聚氰胺、三甲曲沙、醋酸曲普瑞林、双羟萘酸曲普瑞林、UFT、尿苷、戊柔比星、维司力农、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、长春瑞滨、维鲁利秦、ADR-529右旋丙亚胺(zinecard)、净司他丁苯马聚合物、枢复宁、ABI-007、阿卡比芬(acolbifen)、干扰素γ-1b、阿菲尼塔克(affinitak)、氨喋呤、阿佐昔芬(arzoxifen)、阿索匹利尼(asoprisnil)、阿他美坦(atamestane)、阿曲生坦、阿瓦斯汀(avastin)、BAY43-9006(索拉非尼)、CCI-779、CDC-501、西乐葆、西妥昔单抗、克立那托、醋酸环丙氯地孕酮、地西他滨、DN-101、阿霉素-MTC、dSLIM、度他雄胺、埃替卡林(edotecarin)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、依沙替康、芬维A胺、二盐酸组胺、组氨瑞林水凝胶移植物、钬-166DOTMP、伊班膦酸、γ干扰素、内含子-聚乙二醇、伊沙匹隆(ixabepilone)、钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanine)、L-651582、兰瑞肽、拉索昔芬(lasofoxifen)、利泊(libra)、洛那法尼(lonafarnib)、米普昔芬(miproxifen)、米诺膦酸盐(minodronate)、MS-209、脂质体MTP-PE、MX-6、那法瑞林、奈莫柔比星、诺司达(neovastat)、诺拉曲塞、奥利美生(oblimersen)、onko-TCS、奥西姆(osidem)、紫杉醇聚谷氨酸(paclitaxelpolyglutamate)、帕米膦酸二钠、PN-401、QS-21、夸西泮、R-1549、雷洛昔芬、豹蛙酶(ranpirnas)、13-顺式-网状红细胞酸、沙铂、西奥骨化醇、T-138067、特罗凯(tarceva)、塔西普瑞辛(taxoprexin)、胸腺素-α-1、噻唑羧胺核苷、替吡法尼(tipifarnib)、替拉扎明、TLK-286、托瑞米芬(toremifen)、反式MID-107R、伐司朴达、伐普肽、瓦他拉尼(vatalanib)、维替泊芬、长春氟宁(vinflunin)、Z-100、唑来膦酸以及上述的组合组成的群组。15.根据权利要求6所述的构建体，其中所述亲和试剂为单体。16.根据权利要求6所述的构建体，其中所述亲和试剂为蛋白质。17.根据权利要求16所述的构建体，其中所述蛋白质包含至少一种非天然氨基酸。18.根据权利要求16或17所述的构建体，其中所述蛋白质为噬菌体中的蛋白质。19.根据权利要求16或17所述的构建体，其中所述蛋白质为治疗性蛋白质。20.根据权利要求6所述的构建体，其中所述亲和试剂是合成的抗体结构域。21.根据权利要求1至5中任一项所述的构建体，其中所述亲和试剂选自由设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)、HEL4Vh结构域(Predator)、葡萄球菌蛋白A(Affibody)的Z结构域、原型“7kDaDNA结合物”蛋白质家族(Affitin)、碳水化合物结合模块(CBD结构域)、胱氨酸结小蛋白(knottin)、纤连蛋白III型结构域(单体，Adnectin)、γ-B-结晶蛋白(Affilin)、胱抑素(Affimers)、三螺旋线圈结构域(Alhabodies)、脂质运载蛋白结构域(Anticalins)、各种膜受体的结构域(Avimers)、Fyn(Fynomers)的SH3结构域、Kunitz结构域肽及其组合组成的群组。22.根据权利要求1至21中任一项所述的构建体，其中所述连接体为聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、聚(1-羟甲基乙烯羟甲基缩甲醛)(“PHF”)、聚羟基烷基丙烯酸酯、2-甲基丙烯酰氧基-2′-乙基三甲基磷酸铵(“MPC”)或选自以下的结构：其中：m为0至10；n为1至100；每个p独立地为0、1、2、3或4；q为0、1或2；r为1或2；E为NH或CHR10；G为O、CH2、CHOH、CHNH2、CHCOOH或CHSO3H；R10为OH、NH2或COOH；和每个R11独立地为H、OH、NH2或COOH。23.根据权利要求1至22中任一项所述的构建体，其中每种活性酶独立地选自由角质酶、SnapTag、HaloTag、I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域、β-内酰胺酶、糖苷酶、基质金属蛋白酶、细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域、碱性磷酸酶、蛋白-酪氨酸-磷酸酶、23SrRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体、葡萄糖苷酶、N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶、N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶、卤代烷脱卤酶突变体、HNH核酸内切酶、切口核酸内切酶、明胶酶B、明胶酶A、基质分解素、脂肪酸酰胺水解酶、酯酶、细胞色素P450、甲硫氨酸氨肽酶及其组合组成的群组。24.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含角质酶，并且所述第一端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。25.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含SnapTag，并且所述第一末端的所述官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。26.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含HaloTag，并且所述第一末端的所述官能团包含α-氯烷烃。27.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶，并且所述第一末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物。28.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含糖苷酶，并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。29.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶，并且所述第一末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。30.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域，并且所述第一末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。31.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域，并且所述第一末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。32.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。33.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。34.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含23SrRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体，并且所述第一末端的所述官能团包含同源RNA序列。35.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶，并且所述第一末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。36.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶，并且所述第一末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。37.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶，并且所述第一末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。38.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶，并且所述第一端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。39.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由卤代烷烃、卤代芳烃化合物或其衍生物组成的群组的官能团。40.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶，并且所述第一末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。41.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶，并且所述第一末端的所述官能团包括同源DNA切口位点。42.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶B，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。43.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含明胶酶A，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。44.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含基质分解素，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。45.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶，并且所述第一末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。46.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含酯酶，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。47.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s，并且所述第一末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。48.根据权利要求1至23中任一项所述的构建体，其中所述第一融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨肽酶，并且所述第一末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。49.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含角质酶，并且所述第二末端的所述官能团包含对硝基苯膦酸酯。50.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含SnapTag，并且所述第二末端的所述官能团包含O6-苄基鸟嘌呤。51.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含HaloTag，并且所述第二末端的所述官能团包含α-氯代烷烃。52.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含β-内酰胺酶，并且所述第二末端的所述官能团包含克拉维酸或其衍生物。53.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含糖苷酶，并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。54.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质金属蛋白酶，并且所述第二末端的所述官能团包含异羟肟酸-二苯甲酮或其衍生物。55.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含I型DNA拓扑异构酶的松弛酶结构域，并且所述第二末端的所述官能团包含同源oriT寡核苷酸序列。56.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞质蛋白酪氨酸激酶结构域，并且所述第二末端的所述官能团包含半胱氨酸反应ATP结合位点抑制剂。57.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含碱性磷酸酶，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由醌甲基化物、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。58.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含蛋白酪氨酸磷酸酶，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由甲酰色酮、α-卤代膦酸、前述前体、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。59.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含23SrRNA(腺嘌呤(2503)-C(2))-甲基转移酶的突变体，并且所述第二末端的所述官能团包含同源RNA序列。60.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含葡糖苷酶，并且所述第二末端的所述官能团包含苷元或其衍生物。61.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含N-6腺嘌呤特异性DNA甲基化酶，并且所述第二末端的所述官能团包含腺苷或其衍生物。62.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含N(4)-胞嘧啶特异性DNA甲基化酶，并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。63.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶，并且所述第二末端的所述官能团包含胞嘧啶或其衍生物。64.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含卤代烷脱卤酶的突变体，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由卤代烷、卤代芳族化合物或其衍生物组成的群组的官能团。65.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含HNH核酸内切酶，并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。66.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含切口核酸内切酶，并且所述第二末端的所述官能团包含同源DNA切口位点。67.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶B，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物以及前述组合组成的群组的官能团。68.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含明胶酶A，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。69.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含基质分解素，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由环硫乙烷、异羟肟酸、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。70.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含脂肪酸酰胺水解酶，并且所述第二末端的所述官能团包含α-酮噁唑抑制剂或其衍生物。71.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含酯酶，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由膦酸酯、氨基甲酸酯、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。72.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含细胞色素P450s，并且所述第二末端的所述官能团包含选自由亲电类固醇、芳族炔烃、前述衍生物和前述组合组成的群组的官能团。73.根据权利要求1至48中任一项所述的构建体，其中所述第二融合蛋白活性酶包含甲硫氨酸氨基肽酶，并且所述第二末端的所述官能团包含贝洛拉尼或其衍生物。74.一种方法，其包含：(a)将包含亲和试剂和活性酶的第一融合蛋白与包含在第一末端对不可逆地抑制所述第一融合蛋白活性酶具有特异性的官能团的连接体接触，从而在所述第一末端将所述第一融合蛋白与所述连接体偶联，并且(b)将包含亲和试剂和活性酶的第二融合蛋白与所述连接体的第二末端接触，所述连接体的所述第二末端包含对不可逆地抑制所述第二融合蛋白活性酶具有特异性的官能团，从而在搜索第二末端将所述第二融合蛋白与所述连接体偶联。75.根据权利要求74所述的方法，其中步骤(a)和(b)顺序执行。76.根据权利要求74所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。77.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶不同。78.根据权利要求74至76中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白活性酶和所述第二融合蛋白活性酶相同。79.根据权利要求74至78中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂不同。80.根据权利要求74至78中任一项所述的方法，其中所述第一融合蛋白亲和试剂和所述第二融合蛋白亲和试剂相同。81.根据权利要求74至80中任一项所述的方法，其中每个亲和试剂独立地选自由抗体或其片段、小分子、单体、蛋白质及其组合组成的群组。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述亲和试剂为抗体或其片段。83.根据权利要求82所述的方法，其中所述抗体或其...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·姆尔克希奇，J·A·莫迪卡，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：美国,US
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