一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种骨钙素‑N端肽检测试剂及其检测方法和应用，检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素‑N端肽—标记后的第二特定抗体；第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合；本检测试剂能够特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N‑端大分子片段，具有灵敏度高，稳定性好等优点，能很好反映骨量流失及骨转化速率。

【技术实现步骤摘要】
一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用
本专利技术属于试剂诊断研究领域，特别是一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用。
技术介绍
骨钙素的分子生物学特征如下：骨钙素(osteocalcin,OC)又称为γ-羧基谷氨酸蛋白(boneγ-carboxyglutamicacid-containingprotein,BGP),或骨依赖维生素K蛋白(bonevitaminKdependentprotein)。骨钙素是由骨骼中成熟的成骨细胞合成并分泌的一种非胶原蛋白质，是骨细胞外基质的组成成分，约占骨非胶原蛋白的10％～20％。人源的骨钙素在翻译后首先形成98个氨基酸残基的前体肽，其由三部分组成：第一部分是含有26个氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合，使得翻译合成的前体肽定位到内质网上进行剪切；第二部分是含有23个氨基酸残基的信号肽，它可以将内质网上剪切后的肽段定位到细胞膜上；最后一部分是含有49个氨基酸残基的成熟形式，其相对分子质量为5800。成熟形式的骨钙素一部分直接分泌到细胞外，另一部分在分泌之前，会在17、21和24三个谷氨酸的位点被羧基化修饰。羧化过程中至少需要两种酶的催化，一个是受体样跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶(osteoblastproteintyrosinephosphatase，OSTPTP),一个是维生素K依赖的谷氨酸羧化酶(γ-glutamylcarboxylase，GGCX)。此外，骨钙素分子43～44位点上的精氨酸结构很不稳定，在体内血液循环中和离体后血清中均会迅速降解，从而形成多种骨钙素片段(1-43)、(44-49)。根据骨钙素的羧化程度，骨钙素可以分为两种：完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素。完全羧化的骨钙素分子在17、21和24位点有三个羧化的谷氨酸残基以及在23、29位点的半胱氨酸形成的一个分子内二硫键。在Ca2+存在的条件下,16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构,这种构象使三个谷氨酸残基突向同一方向排列,促进其与羟基磷灰石的结合，从而沉积在骨基质中发挥作用；而未羧化或是羧化不完全的骨钙素则不存在上述生物学活性。完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素被释放到血液中，通过循环作用参与除骨代谢以外的其他代谢调节。此外，骨吸收和溶解时，破骨细胞分泌酸性物质，使得骨基质中pH值降低，沉积在骨基质中骨钙素可能发生脱羧反应，从骨基质中游离出来，释放入血液循环系统，参与骨钙素的代谢调节作用。在正常人群和代谢性骨病患者的血液循环及血清中都存在完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素。未羧化的骨钙素分子(Glu-OC【1-49】)：肽链：Tyr—Leu—Tyr—Gln—Trp—Leu—Gly—Ala—Pro—Val—Pro—Tyr—Pro—Asp位点：1234567891011121314—Pro—Leu—Glu—Pro—Arg—Arg—Glu—Val—Cys—Glu—Leu—Asn—Pro15161718192021222324252627—Asp—Cys—Asp—Glu—Leu—Ala—Asp—His—Ile—Gly—Phe—Gln—Glu28293031323334353637383940—Ala—Tyr—Arg—Arg—Phe—Tyr—Gly—Pro—Val414243444546474849序列为：YLYQWLGAPVPYPDPLEPRREVCELNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV；其中，氨基酸肽链中位点17、21、24为未羧化的谷氨酸，即α-氨基戊二酸(L-glutamicAcid,Glu)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。完全羧化的骨钙素分子(Gla-Oc【1-49】)：肽链：Tyr—Leu—Tyr—Gln—Trp—Leu—Gly—Ala—Pro—Val—Pro—Tyr—Pro—Asp位点：1234567891011121314—Pro—Leu—Gla—Pro—Arg—Arg—Gla—Val—Cys—Gla—Leu—Asn—Pro15161718192021222324252627—Asp—Cys—Asp—Glu—Leu—Ala—Asp—His—IIe—Gly—Phe—Gln—Glu28293031323334353637383940—Ala—Tyr—Arg—Arg—Phe—Tyr—Gly—Pro—Val414243444546474849序列为：其中，氨基酸肽链中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，即γ-羧基谷氨酸(γ-CarboxyglutamicAcid,Gla)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。不完全羧化的骨钙素分子：氨基酸肽链中位点17、21、24中至少有一个位点是未羧化的谷氨酸，即γ-羧基谷氨酸(γ-CarboxyglutamicAcid,Gla)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。骨钙素在外周血液中的存在形式是：无论是完全羧化还是不完全羧化及未羧化的成熟的骨钙素分子，都很不稳定，第43～44位点的精氨酸结构被认为可能是胰酶水解的位点，因此在外周血液循环中的骨钙素完整分子大约占36％，氨基端中段大分子片段大约占30％，其他大约34％由氨基端中段和羧基端小分子片段组成。第一代-第二代-第三代骨钙素检测内容如下：血清骨钙素检测(第一代)：检测上述完全羧化、不完全羧化和未羧化的的骨钙素分子全段1-49；该测试试剂不能同等摩尔检测骨钙素分子全段1-49和其降解后的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43，该检测不能特异性区分氨基酸肽链序列第17、21和24位点完全羧化和未羧化的骨钙素。骨钙素N端中分子片段检测(第二代)：检测上述完全羧化、不完全羧化和未羧化的骨钙素分子全段1-49和其降解后的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43；该检测不能特异性区分氨基酸肽链序列第17、21和24位点完全羧化和未羧化的骨钙素。骨钙素-N端肽检测(第三代)：检测上述完全羧化的骨钙素分子全段1-49(Gla-Oc【1-49】)和降解后完全羧化的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43(Gla-Oc【1-43】)。该测试试剂不检测氨基酸肽链序列第17、21和24位点未羧化的骨钙素，即Glu-Oc(1-49)和Glu-Oc(1-43)。骨钙素-N端肽定义：完全羧化的骨钙素(Gla-Oc【1-49】)分子在外周血中不很稳定，羧基端43和44之间的氨基酸链易被蛋白酶水解，裂解后的大片段(氨基酸1-43)称为完全羧化的骨钙素-N端片段(Gla-Oc【1-43】)，其包含了完全羧化的骨钙素分子中17、21和24三个钙结合位点，具有与羟基磷灰石结合的生物学活性及使骨骼组织矿物化的功能。骨钙素-N端肽指血清中完全羧化的成熟骨钙素(Gla-Oc【1-49】)和完全羧化的骨钙素-N端片段(Gla-Oc【1-43】)的总和，其血清中的浓度比较稳定，检测骨钙素-N端肽能较好地反映近期骨转换以及骨量流失的情况本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种骨钙素‑N端肽检测试剂，其特征在于，包括：免疫复合体，抗体检测体系；所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素‑N端肽—标记后的第二特定抗体；所述第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，其中氨基酸序列中的17、21、24三个位点为完全羧化的谷氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：免疫复合体，抗体检测体系；所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素-N端肽—标记后的第二特定抗体；所述第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，其中氨基酸序列中的17、21、24三个位点为完全羧化的谷氨酸。2.根据权利要求1所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，所述第一特定抗体，第二特定抗体是由：一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第16-43位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。3.根据权利要求2所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，所述第一特定抗体，第二特定抗体是由抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；结合位点包括：一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-25位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。4.根据权利要求1所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，所述抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。5.根据权利要求4所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：生物素标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；待测样本；链霉亲和素包被的磁微粒；清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。6.根据权利要求4所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：兔骨钙素多克隆抗体；标记物标记的骨钙素鼠单克隆抗体；骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；待测样本；羊抗兔IgG包被的磁微粒；清洗液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高平，
申请(专利权)人：嘉兴行健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33