一种低成本、简单快速的糖蛋白N-糖链分析方法技术

本发明专利技术提供了一种低成本、简单快速的糖蛋白N‑糖链定量分析方法，它包括如下步骤：(1)糖蛋白加热变性后进行还原烷基化处理；(2)在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N‑糖链，离心收集N‑糖链；(3)使用亲水作用色谱纯化富集N‑糖链；(4)去除唾液酸后，干燥浓缩；(5)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析N‑糖链。本发明专利技术操作简单、快速，可广泛适用于不同来源的糖蛋白的N‑糖链的分析，分析结果稳定可靠，应用前景广。

【技术实现步骤摘要】
一种低成本、简单快速的糖蛋白N-糖链分析方法
本专利技术涉及生物化学领域，尤其涉及一种糖蛋白N-糖链分析方法。
技术介绍
糖蛋白上连接的N-糖链是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰半乳糖、唾液酸等单糖通过糖苷键连接而成的分子。N-糖链在内质网表面经糖基转移酶催化，与新生成的蛋白质上的天冬酰胺残基通过N-糖苷键连接，并进入内质网和高尔基体内发生一系列后续加工。N-糖基化通常发生在保守的氨基酸序列N-X-T/S(X≠P)中，根据五糖核心外围糖链的延长方式不同，其又可以分为高甘露糖型、杂合型以及复合型，不同的糖链结构各自发挥重要的调控功能。大量研究结果表明，细胞表面N-糖链异常变化与肿瘤细胞的侵袭和转移等有密切关系。研究N-糖链的结构变化对于阐明糖链在肿瘤和疾病发生发展中的作用，糖链标志物的发现以及早期诊断、治疗乃至药物的研发具有重要意义。但是N-糖链分析难度较大，主要在于其含量低、种类和结构复杂、异质性等，因此N-糖链定量分析的前处理(纯化)显得尤为重要公告号为CN102788720B的专利文件(一种滤膜辅助分离生物样本中糖蛋白全N-接糖链及其鉴别方法)公开了一种N-糖链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种低成本、简单快速的糖蛋白N‑糖链定量分析的前处理方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)糖蛋白加热变性后进行还原烷基化处理；(2)在超滤管中使用PNGase F蛋白酶切除糖肽上的N‑糖链，离心收集N‑糖链；(3)使用亲水作用色谱纯化富集N‑糖链；(4)去除唾液酸后，干燥浓缩。

【技术特征摘要】
1.一种低成本、简单快速的糖蛋白N-糖链定量分析的前处理方法，其特征在于，它包括如下步骤：(1)糖蛋白加热变性后进行还原烷基化处理；(2)在超滤管中使用PNGaseF蛋白酶切除糖肽上的N-糖链，离心收集N-糖链；(3)使用亲水作用色谱纯化富集N-糖链；(4)去除唾液酸后，干燥浓缩。2.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述的还原烷基化处理为：分别使用二硫苏糖醇和碘乙酰胺处理。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇处理为：50-60℃振荡反应30-60min。4.如权利要求2所述的前处理方法，其特征在于，所述碘乙酰胺处理为：加入终浓度30-70mmol/L碘乙酰胺在室温避光反应0.5-1.5h。5.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(2)所述的酶切反应在条件是：酶用量：每20μg糖蛋白使用1U的酶；反应温度：37℃；反应时间：2h。6.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(3)使用的色谱填料是博纳爱杰尔的VenusilHILIC填料。7.如权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川,51