一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法技术

一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法，步骤为：取多只感染肝肠胞虫的对虾肝胰腺，去膜研磨；用无菌水稀释至35‑40ml；在1500‑2000rpm及500‑600rpm交替离心至肉眼观察无沉淀为止；再将无沉淀的上清液在3000‑3500rpm高速离心后取沉淀，将沉淀溶解在无菌水中作为粗提液；采用不同浓度的Percoll细胞分离液进行梯度分离；在铺好梯度的液面最顶部，加入1ml‑1.5ml粗提液；用离心机在15℃，9000‑10000rpm条件下离心；洗涤得到纯化的肝肠胞虫悬浮液。本发明专利技术纯化的虫体纯度高、杂质少，操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法
本专利技术属于微孢子虫纯化
，特别是涉及一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法。
技术介绍
虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于微孢子虫科、肠胞虫属，是一种高传染性细胞内寄生的微孢子虫，于2009年首次在泰国生长缓慢的养殖斑节对虾(Penaeusmonodon)的肝胰腺小管上皮细胞内被分离而命名，近年来在泰国、印度、越南、印度尼西亚和中国等主要对虾养殖国家中传播流行，主要感染凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)和斑节对虾等经济养殖虾类，可造成对虾生长极其缓慢或停滞，严重影响对虾产量和经济价值，是危害全球对虾养殖产业的重要疾病之一。自2013年以来，我国沿海多个对虾养殖地区先后检出EHP，并且感染率有逐年上升的趋势。2015年浙江地区的134份虾苗样品的EHP检出率为53.8％；粤西地区87份凡纳滨对虾样品的EHP检出率为41.38％，辽宁省营口市、盘锦市的凡纳滨对虾EHP检出率达34.6％，其中小个体虾中检出率高达100％。肝肠胞虫发病率高，传播力强，预防难度大，目前尚无有效治疗方法，因此急需开展防治研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：冰上取多只感染肝肠胞虫的对虾肝胰腺，去膜，用研磨棒在研钵中进行研磨，直至无明显组织块；S2:研磨液用20‑30ml无菌水稀释，用细胞过滤器过滤至离心管中，将带有肝肠胞虫的滤液用无菌水稀释至35‑40ml；S3:通过离心机对上述S2步骤中得到的过滤液进行离心，1500‑2000rpm的条件下离心10‑15min，弃上清液取沉淀；加入20‑30ml无菌水溶解沉淀，用离心机在500‑600rpm低速条件下离心30s‑1min，为一个离心工作循环；肉眼观察是否有沉淀，若有沉淀，取上清液重复上述离心工作循环的操作步骤，直至肉眼观察无沉淀...

【技术特征摘要】
1.一种用于纯化对虾肝肠胞虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：冰上取多只感染肝肠胞虫的对虾肝胰腺，去膜，用研磨棒在研钵中进行研磨，直至无明显组织块；S2:研磨液用20-30ml无菌水稀释，用细胞过滤器过滤至离心管中，将带有肝肠胞虫的滤液用无菌水稀释至35-40ml；S3:通过离心机对上述S2步骤中得到的过滤液进行离心，1500-2000rpm的条件下离心10-15min，弃上清液取沉淀；加入20-30ml无菌水溶解沉淀，用离心机在500-600rpm低速条件下离心30s-1min，为一个离心工作循环；肉眼观察是否有沉淀，若有沉淀，取上清液重复上述离心工作循环的操作步骤，直至肉眼观察无沉淀为止；将无沉淀的上清液用离心机在3000-3500rpm条件下离心5-10min，弃上清取沉淀，将沉淀溶解在1-2ml的无菌水中作为粗提液备用；S4：采用不同浓度的Percoll细胞分离液进行梯度分离：将由小到大浓度Percoll使用液依次注入试管最底部，每种浓度的使用液注入量为1.5ml-2ml；S5：在铺好梯度的液面最顶部，通过注射器加入1ml-1.5ml粗提液，加入速度保证在加入过程中能清晰看到各梯度之间的分界；S6：用离心机在15℃，9000-10000rpm条件下离心30-40min；S7：洗涤：用注射器吸取最底层梯度处的含有肝肠胞虫的条带于离心管中，离心机在3000-3500rpm条件下，离心5-8min，弃上清，用3-5倍体积的无菌水悬浮沉淀；重复操作3次，得到纯化的肝肠胞虫悬浮液。2.根据权利要求1所述用于纯化对虾肝肠胞虫的方法，其特征在于：所述Percoll梯度溶液的制备在0-4℃环境中进行，具体配制...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宏波，宁梓健，陈启军，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21