来自粗制膜的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒及文库制造技术

本发明专利技术涉及一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；b)在液体环境中使步骤a)的混合物与脂质结合多肽相接触；以及c)进行所述颗粒的自组装。本发明专利技术还提供了制备纯化的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的方法，其包括根据上述方法制备文库的步骤以及f)从该文库中纯化出鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒的附加步骤。此外，本发明专利技术提供了能够根据本发明专利技术的方法得到的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库以及鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒。这些物质可用于医药，特别是用于预防、治疗疾病或减轻疾病的严重程度，或用于诊断方法、美容处理或用作疫苗接种制剂或作为以下方面的工具：药物研发、药物筛选、药物探索、抗体研发、治疗性生物制剂研发、膜或膜蛋白纯化、膜蛋白表达、膜和/或膜蛋白研究，特别是脂质组学和蛋白质组学，优选膜和/或膜蛋白的分离、鉴定和/或研究或创建脂质组或蛋白质组数据库。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来自粗制膜的鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒及文库
本专利技术涉及制备来自细胞膜或细胞器膜的脂蛋白颗粒文库并从中纯化脂蛋白颗粒的方法，本专利技术还涉及脂蛋白颗粒文库和纯化的脂蛋白颗粒本身以及它们的用途。
技术介绍
在过去十年中，在生命科学(特别是药物探索)方面的研究已迅速发生变化。随着分子生物学、计算、基因组学、蛋白质组学和脂质组学的进展，新型研究方法和药物探索得以发展。在这一研究领域中，已证实细胞或细胞器的基因组、蛋白质组或脂质组的文库在研究基因、蛋白质或脂质功能以及探索基因、蛋白质或脂质药物靶标方面非常有用。虽然基因组和DNA文库领域进展良好，但仍迫切需要开发用于制备膜蛋白质组和/或脂质组文库的改进方法。药物探索基于对在某些疾病中具有特定生理活性的先导化合物的探索、选择和进一步研发和/或(如果可得到化合物文库)对疾病所涉及的细胞中的新药物靶标的鉴定。药物靶标通常是脂质、脂质结构域或膜蛋白，例如，嵌入靶细胞的细胞膜或细胞器膜中的受体或转运蛋白。因此，通常在生命科学中，并且特别是在新型药物的研发中，非常需要阐明嵌入其天然膜环境中的脂质、脂质结构域和膜蛋白的结构和功能，以及针对可能的脂质和膜蛋白靶标的复杂文库而筛选化合物或化合物文库的可能性。对于细胞或细胞器的可溶性蛋白质，通过简单地分离可溶性蛋白质部分，可以容易地制备可溶性细胞或细胞器蛋白质组的文库。遗憾的是，在通常用于药物筛选方法和生命科学研究中采用的大多数功能检验的无去垢剂系统中，细胞膜(以及其中所含的膜蛋白和脂质)是不溶的。因此，目前的膜蛋白质组或脂质组文库大多处于去垢剂溶解状态或处于变性状态。后者可用于蛋白质或脂质鉴定技术，如质谱，但不适合进行膜蛋白或脂质在其天然环境中的功能分析，而此类分析是该领域中成功研究和药物研发的基本要求。在纯化、分离和功能分析中的这些困难延误了对膜脂质组和膜蛋白质组的研究。脂质组学是对生物系统中细胞脂质的途径、组成和网络的大规模研究，并涉及对细胞脂质分子种类的鉴定和量化以及细胞脂质分子与其他脂质、蛋白质和其他代谢物的相互作用。“脂质组”一词用于描述细胞、组织、生物体或生态系统的所有脂质和/或脂质谱的总和，并且是“代谢物组”的子集，代谢物组还包括其他主要类别的生物分子：蛋白质、氨基酸、糖类和核酸。脂质组学是一个相对较新的研究领域，其发展受到以下方面的推动：质谱法(MS)、核磁共振(NMR)谱学、荧光光谱学和计算方法等技术的快速发展以及对脂质在肥胖、动脉粥样硬化、中风、高血压和糖尿病等许多代谢疾病中的作用的认知。这个快速发展的领域补充了基因组学和蛋白质组学方面的巨大发展，所有这些构成了系统生物学家族。脂质组非常复杂，并且脂质在膜动力学、能量代谢和信号转导中起重要作用，其中脂质结构是生物效应的关键决定因素。脂质组学等分析方法对于提高目前对基础研究和药物探索和研发中的生物学相关脂质的生物学理解至关重要。为此，希望能够提供这样的脂质组文库，其中脂质处于尽可能接近其在细胞膜或细胞器膜中的天然环境的状态。脂质组学研究方法适用于所有治疗领域，包括心血管疾病、糖尿病、癌症、神经性疾病和自身免疫，以及炎性疾病。成功的脂质组学研究的基本要求是足够的预分析样品，优选能够快速生产、容易处理且储存时间短的脂质组文库，这是因为一些脂质和天然存在的脂质结构域可能是不稳定的。在许多领域中，脂质还提供了新型生物标志物解决方案的前景。此外，脂质还可以作为实验性疗法或现有疗法的潜在药效学读出(pharmacodynamicread-out)。因此，脂质也可以促进成对诊断发展从而支持更为个性化的治疗方法。同样在这方面，期望提供用于制备脂质组文库的方便且有力的方法。脂质组学也可用于研究各种实验性疾病模型，而这可以为转化医学提供巨大的帮助。另一方面，蛋白质组学是对蛋白质，特别是蛋白质的结构和功能的大规模研究。由于蛋白质是细胞生理代谢和信号转导途径的主要成分，因而蛋白质是活生物体的重要组成部分。蛋白质组是生成并包含在生物体、细胞、细胞器或系统中的一组蛋白质。膜蛋白质组是生成并包含在生物体、细胞、细胞器或系统的膜中的一组膜蛋白和膜相关蛋白。蛋白质组van随着时间和细胞或生物体所经历或体验的条件或应激(例如，在疾病中)而变化。膜蛋白质组是一个特别有趣的研究对象，因为膜蛋白在细胞系统和疾病中发挥了许多功能。由于包含给定细胞膜或细胞器膜的膜蛋白质组的文库富含潜在的药物靶标，因此其对于筛选方法是非常需要的。此外，未知膜蛋白的分离和鉴定提供了探索新的药物靶标和鉴定关键生化受体的前景。如上所述，迄今为止，膜蛋白质组文库的制备和随后的用途受到膜和膜成分在无去垢剂系统中的不溶性的阻碍。由于膜蛋白在无去垢剂系统中的不溶性，使得难以在体外研究膜蛋白靶标与可溶性配体之间的相互作用。膜蛋白和脂质等疏水性化合物非常难以处理，并且制药和生命科学研究和应用中具有两个主要的挑战：(i)为脂质等不可溶的疏水性化合物或膜蛋白提供在水溶液中的可溶性，以及(ii)将这类疏水性物质作为治疗、研究或诊断制剂进行处理和施用。膜蛋白由全部ORF的大约30％编码(参见文献“Wallin和vonHeijne,ProteinScience1998Apr；7(4):1029-38”)，并且由于大部分(即，大于60％)药物实际上靶向这类蛋白，因此其代表了一类重要的药物靶点(参见文献“Overington等人,NatureReviewsDrugDiscovery5,993-996(December2006)”)。膜蛋白在许多生物过程中发挥重要作用，如信号转导、分子和能量运输、识别和细胞通讯。然而，当将膜蛋白从其天然脂双层环境中提取出来后，膜蛋白由于其不溶性和趋于聚集的性质而难以研究。为了维持膜蛋白的完整性，需要人造的疏水环境。在此，去垢剂胶束是最常使用的，然而其会对生物相容性产生负作用，能够对膜蛋白的活性产生不利影响，并且可能会干扰检验的实验条件。另一个主要的药理学挑战是，施用和递送疏水性蛋白和/或脂质作为治疗剂或诊断剂。由于这些疏水性试剂的溶解度有限，它们趋于聚集，这将导致局部药物颗粒浓度高，从而会导致高的毒性、不希望的免疫反应，并且会使药物失活(参见文献“Allen和Cullis,SCIENCE,303(5665):1818-1822,MAR19,2004”)。因此，非常需要将诸如膜蛋白或脂质等疏水试剂纳入可溶性的颗粒中的应用。目前，解决这两个挑战的方法主要涉及脂质体和重组高密度脂蛋白(rHDL)颗粒(参见文献“Chan和Boxer,CurrentOpinioninchemicalBiology11:1-7,2007”)。EP1596828B1公开了盘状生物活性试剂递送颗粒，包含以双带样形式紧密包围脂双层的载脂蛋白。上述颗粒的内部由脂双层的疏水区域形成。这与具有含水内部的封闭球状双层壳的脂质体不同。EP1596828B1中公开的盘状生物活性试剂递送颗粒的斯托克斯直径约为10nm，并且提出了将其用作疏水性药物如两性霉素B或喜树碱的递送载体。EP1345959B1公开了相似类型的直径约10nm、高度约5.5nm的纳米颗粒。该颗粒为盘状，并且由(i)人工膜脚手架蛋白、(ii)磷脂双分子层和(iii)至少一种疏水性或部分疏水性膜蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；b)在液体环境中使步骤a)的所述混合物与所述脂质结合多肽相接触；c)进行所述颗粒的自组装。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.19 EP 16184843.71.一种制备鞘脂激活蛋白脂蛋白颗粒文库的方法，其中所述颗粒包含来自细胞膜或细胞器膜的膜成分以及脂质结合多肽，所述脂质结合多肽是属于脂质相互作用蛋白SAPLIP家族的鞘脂激活蛋白样蛋白或其衍生物形式，其中所述方法包括以下步骤：a)提供得自细胞膜或细胞器膜的粗制膜囊泡的混合物；b)在液体环境中使步骤a)的所述混合物与所述脂质结合多肽相接触；c)进行所述颗粒的自组装。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的所述粗制膜囊泡是通过以下步骤中的至少一个步骤或全部步骤制备的：a.1)提供细胞和/或细胞器；a.2)使所述细胞和/或所述细胞器裂解或破裂；a.3)得到粗制膜部分；以及a.4)由步骤a.3)中得到的所述粗制膜部分制备粗制膜囊泡。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法在步骤a)和步骤b)之间还包括以下步骤：b.1)在液体环境中使所述粗制膜囊泡与去垢剂相接触；其中，然后在步骤b)中，使步骤b.1)中得到的混合物在步骤c)中与脂质结合多肽相接触和/或其中步骤b)在去垢剂的存在下进行。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述去垢剂选自由下列组成的组：烷基苯磺酸盐或胆汁酸、阳离子去垢剂和非离子去垢剂或两性离子去垢剂如十二烷基-二甲胺-氧化物(LDAO)、Fos-胆碱、CHAPS/CHAPSO、烷基糖苷如短、中链或长链烷基麦芽糖苷、特别是正十二烷基β-D-麦芽糖苷、葡糖苷、麦芽糖-新戊二醇(MNG)两亲化合物、两亲性聚合物(amphipols)、基于苯酚和醛的羟烷基化产物的大环化合物或环状低聚物(杯芳烃)以及它们的混合物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中i)所述颗粒为盘状，特别是其中所述颗粒为盘状并且不包含亲水或水性核心，ii)所述颗粒的最大直径通常为2nm至200nm，特别是3nm至150nm，优选3nm至100nm；ii)在如下pH下进行步骤c)中所述颗粒的自组装：2.0至10.0，特别是6.0至10.0，优选6.0至9.0，特别优选7.0至9.0，并且最优选7.0至8.0和/或iii)其中所述方法在步骤c)中或作为后续步骤d)包括通过至少部分除去游离膜脂质、游离膜蛋白、游离脂质结合多肽、不溶性物质或聚集物质和/或去垢剂来进行所述颗粒的纯化，其中，任选地，通过下列方法进行所述纯化：色谱法，特别是尺寸排阻色谱；超速离心；透析；接触去垢剂结合型生物珠子；使用浓缩器；亲和纯化方法，包括但不限于色谱法、磁珠、免疫纯化和/或膜/过滤器，从而除去未结合的/未纳入的脂质和/或疏水性化合物。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述脂质结合蛋白是鞘脂激活蛋白A、鞘脂激活蛋白B、鞘脂激活蛋白C、鞘脂激活蛋白D或其衍生物或截短形式，并且其中，任选地，SAPLIP的衍生物形式选自i)与SEQIDNO.1、2、3、4、5...

【专利技术属性】
技术研发人员：延斯·弗劳恩菲尔德，罗宾·勒文，
申请(专利权)人：塞利普洛生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE