表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物制造技术

本文提供了与表达外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的非人动物相关的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物相关申请本申请要求2016年6月3日提交的美国临时专利申请序列号62/345,524的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
已经证明非人动物，特别是小鼠和大鼠是治疗性抗体的有价值来源，并且可能作为其他抗原结合分子的来源。这种非人动物中高水平的抗原受体多样性增加了免疫后产生具有所需治疗特性的抗原结合分子的可能性。因此，需要具有增加的抗原受体多样性的基因工程非人动物，以改善治疗性抗原结合分子的产生。
技术实现思路
在某些方面，本文提供了遗传修饰的非人动物，其在其基因组中包含编码末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的外源核酸，以及制备和使用此类非人动物的方法。在一些实施方案中，外源性TdT是人TdT。在一些实施方案中，外源性TdT是内源性物种来源的(例如，在小鼠中，外源性TdT具有小鼠序列)。在一些实施方案中，本文提供的非人动物在B细胞发育期间表达由外源核酸编码的TdT，例如，在pro-B细胞和/或pre-B细胞中。在一些实施方案中，本文提供的非人动物在T细胞发育期间表达由外源核酸编码的TdT，例如，在双阴性(DN)胸腺细胞和/或双阳性(DP)胸腺细胞中。在一些实施方案中，遗传修饰的非人动物包含编码TdT的多拷贝的外源核酸(例如，至少2、3、4、5、6、7或8个拷贝)。在一些实施方案中，遗传修饰的非人动物是哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一些实施方案中，遗传修饰的非人动物在其基因组中包含免疫球蛋白可变区，其包含与免疫球蛋白恒定区基因(例如重链恒定区基因、κ链恒定区基因、λ链恒定区基因)可操作地连接的未经重排的人免疫球蛋白可变区基因区段(例如重链基因区段、κ链基因区段、λ链基因区段)。在一些实施方案中，恒定区基因是人恒定区基因、小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因是内源物种来源。在一些实施方案中，可变区和恒定区基因位于内源免疫球蛋白基因座(例如，重链基因座、κ基因座、λ基因座)中。在一些实施方案中，遗传修饰的非人生物表达包含衍生自免疫球蛋白可变区的人免疫球蛋白可变结构域和由免疫球蛋白恒定区基因编码的免疫球蛋白恒定结构域的抗体。在一些实施方案中，本文提供了使用这种遗传修饰的非人动物产生抗体、B细胞、杂交瘤或编码人免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法。在某些实施方案中，遗传修饰的非人动物在其基因组中包含T细胞受体(TCR)可变区，其包含未重排的人TCR可变区基因区段(例如，TCRα基因区段、TCRβ基因区段、TCRγ基因区段、TCRδ基因)，其可操作地连接TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因、TCRβ恒定区基因、TCRγ恒定区基因、TCRδ恒定区基因)。在一些实施方案中，恒定区基因是人恒定区基因、小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因是内源物种来源。在一些实施方案中，可变区和恒定区基因位于内源TCR基因座(例如TCRα基因座、TCRβ基因座、TCRγ基因座、TCRδ基因座)。在一些实施方案中，遗传修饰的非人生物表达TCR，其包含衍生自TCR可变区的人TCR可变结构域和由TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。在一些实施方案中，本文提供了使用这种遗传修饰的非人动物产生TCR、T细胞、T细胞杂交瘤或编码人TCR可变结构域的核酸的方法。在一些实施方案中，遗传修饰的非人动物在其基因组中包含免疫球蛋白可变区，其包含与TCR恒定区基因(例如，TCRα恒定区基因、TCRβ恒定区基因、TCRγ恒定区基因、TCRδ恒定区基因)可操作地连接的未经重排的人免疫球蛋白可变区基因区段(例如，重链基因区段、κ链基因区段、λ链基因区段)。在一些实施方案中，恒定区基因是人恒定区基因、小鼠恒定区基因或大鼠恒定区基因。在一些实施方案中，恒定区基因是内源物种来源。在一些实施方案中，可变区和恒定区基因位于内源TCR基因座(例如TCRα基因座、TCRβ基因座、TCRγ基因座、TCRδ基因座)。在一些实施方案中，遗传修饰的非人生物表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含衍生自免疫球蛋白可变区的人免疫球蛋白可变结构域和由TCR恒定区基因编码的TCR恒定结构域。在一些实施方案中，本文提供了使用这种遗传修饰的非人动物产生CAR、T细胞、T细胞杂交瘤或编码人免疫球蛋白可变结构域的核酸的方法。在一些实施方案中，本文提供了制备本文公开的非人动物的方法，包括改造非人动物以在其种系中包含本文所述的遗传修饰。在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述遗传修饰的非人ES细胞。附图说明图1描绘了示例性靶向载体(未按比例)的图，其中小鼠Rag2基因的一部分被编码短同种型人TdT(hTdT)的DNA序列替换。在示例性实施方案中，载体随机整合到基因组中。除非图中的标记另有说明(例如，对于选择盒、loxP位点等)，填充的形状和单行代表小鼠序列，空的形状和双线代表人序列。E1、E2等代表特定图解基因的外显子，GFP是绿色荧光蛋白，CM是氯霉素抗性基因，neo是新霉素抗性基因。连接点1-4对应于表1中所示的连接点。图2描绘了示例性靶向载体(未按比例)的图，其中小鼠Rag2基因的一部分被编码短同种型人TdT(hTdT)的DNA序列替换。在所描绘的实施方案中，载体用于将由小鼠RAG2启动子驱动的hTdT插入Igκ基因座。除非图中的标记另有说明(例如，对于选择盒、loxP位点等)，填充的形状和单行代表小鼠序列，空的形状和双线代表人序列。E1、E2等代表特定图解基因的外显子，GFP是绿色荧光蛋白，CM是氯霉素抗性基因，hyg是潮霉素抗性基因。连接点1-7对应于表2中的连接点。图3描绘了用于将由VH1-72启动子和Eμ+增强子驱动的编码人TdT(hTdT)的DNA序列插入免疫球蛋白κ基因座的示例性靶向载体(未按比例)的图。除非图中的标记另有说明(例如，对于选择盒、loxP位点等)，填充的形状和单行代表小鼠序列，空的形状和双线代表人序列。E1、E2等代表特定图解基因的外显子，GFP是绿色荧光蛋白，CM是氯霉素抗性基因，hyg是潮霉素抗性基因。连接点1-4对应于表3中的连接点。图4描绘了与对照小鼠相比，小鼠的淋巴细胞中hTdTmRNA的表达。本文的小鼠是包含多种库(diverserepertoire)未重排的人重链和κ轻链可变(V(D)J)基因区段的小鼠。Het表示杂合小鼠，HO表示纯合小鼠。图5描绘了显示与对照小鼠相比，表达hTdT的小鼠中hIgκ序列多样性(每10,000hIgκ测序读数的独特轻链CDR3序列的数量)的图。Het表示杂合小鼠，HO表示纯合小鼠。图6描绘了显示与对照小鼠相比，表达hTdT的小鼠中hIgκ非模板添加物的分布的图。Het表示杂合小鼠，HO表示纯合小鼠。“NT”代表核苷酸。图7有两个图板。图板(A)描绘了显示与对照小鼠相比，表达hTdT的小鼠中hIgκCDR3长度的分布的图。“AA”代表氨基酸。图板(B)描绘了显示与对照小鼠相比，在表达hTdT的小鼠中JK区段的5'区域的核酸外切酶缺失长度频率的图。Het表示杂合小鼠，HO表示纯合小鼠。图8有两个图板。图板(A)描绘了显示与对照小鼠相比，表达hTdT的小鼠中Vκ使用的图。图板(B)描绘了显示与对照小鼠相比，表达hTdT的小鼠中Jκ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种遗传修饰的非人动物，其在其基因组中包含：编码与转录控制元件可操作连接的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的核酸序列；和免疫球蛋白可变区，其包含与免疫球蛋白恒定区基因可操作连接的未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.03 US 62/345,5241.一种遗传修饰的非人动物，其在其基因组中包含：编码与转录控制元件可操作连接的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的核酸序列；和免疫球蛋白可变区，其包含与免疫球蛋白恒定区基因可操作连接的未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段。2.根据权利要求1所述的遗传修饰的非人动物，其中所述转录控制元件驱动编码外源性TdT的核酸序列在pro-B细胞和/或前B细胞中的表达。3.根据权利要求2所述的遗传修饰的非人动物，其中所述转录控制元件选自RAG1转录控制元件、RAG2转录控制元件、免疫球蛋白重链转录控制元件、免疫球蛋白κ轻链转录控制元件和/或免疫球蛋白λ轻链转录控制元件。4.根据权利要求1至3中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中编码外源性TdT的核酸序列位于免疫球蛋白κ轻链基因座、免疫球蛋白λ轻链基因座、免疫球蛋白重链基因座、RAG1基因座、RAG2基因座。5.根据权利要求1至4中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中所述动物中至少10％的V-J免疫球蛋白轻链连接包含非模板添加。6.根据权利要求1至5中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中所述人免疫球蛋白可变区基因区段是人重链可变区基因区段。7.根据权利要求6所述的遗传修饰的非人动物，其中所述恒定区基因是重链恒定区基因。8.根据权利要求7所述的遗传修饰的非人动物，其中所述重链恒定区基因是内源物种来源的。9.根据权利要求6至8中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中所述免疫球蛋白可变区和所述免疫球蛋白恒定区基因位于内源免疫球蛋白重链基因座。10.根据权利要求6至9中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其在其基因组中还包含免疫球蛋白可变区，其包含与第二免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的未重排的人轻链可变区基因区段。11.根据权利要求10所述的遗传修饰的非人动物，其中与第二免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的免疫球蛋白可变区位于内源免疫球蛋白轻链基因座。12.根据权利要求11所述的遗传修饰的非人动物，其中与第二免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的人免疫球蛋白可变区基因区段是人κ链可变区基因区段。13.根据权利要求11所述的遗传修饰的非人动物，其中与第二免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的人免疫球蛋白可变区基因区段是人λ链可变区基因区段。14.根据权利要求11至13中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中所述第二恒定区基因是κ恒定区基因。15.根据权利要求11至13中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中所述第二恒定区基因是λ恒定区基因。16.根据权利要求14所述的遗传修饰的非人动物，其中所述κ恒定区基因是内源物种来源的。17.根据权利要求15所述的遗传修饰的非人动物，其中所述λ恒定区基因是内源物种来源的。18.根据权利要求16所述的遗传修饰的非人动物，其中内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ基因座。19.根据权利要求17所述的遗传修饰的非人动物，其中内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白λ基因座。20.根据权利要求1至19任一项所述的遗传修饰的非人类动物，其中未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段在B细胞发育期间经历重排以在非人动物的B细胞中产生重排的可变区基因。21.根据权利要求20所述的遗传修饰的非人动物，其中至少10％的重排可变区基因包含非模板添加物。22.一种遗传修饰的非人动物，其在其基因组中包含：编码与转录控制元件可操作连接的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的核酸序列；和T细胞受体(TCR)可变区，其包含与TCR恒定区基因可操作连接的未重排的人TCR可变区基因区段。23.根据权利要求22所述的遗传修饰的非人动物，其中所述人TCR可变区基因区段是人TCRα可变区基因区段。24.根据权利要求22所述的遗传修饰的非人动物，其中所述人TCR可变区基因区段是人TCRβ可变区基因区段。25.根据权利要求22至24中任一项所述的遗传修饰的非人动物，其中未重排的人TCR可变区基因区段在T细胞发育期间经历重排以在非人动物的T细胞中产生重排的TCR可变区基因。26.根据权利要求25所述的遗传修饰的非人动物，其中至少10％的重排可变区基因包含非模板添加物。27.一种遗传修饰的非人动物，其在其基因组中包含：编码与转录控制元件可操作连接的外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的核酸序列；和免疫球蛋白可变区，其包含与TCR恒定区基因可操作连接的未重排的人免疫球蛋白可变区基因区段。28.根据权利要求27所述的遗传修饰的非人动物，其中所述人免疫球蛋白可变区基因区段是重链基因区段。29.根据权利要求27所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·麦克唐纳，A·J·莫菲，C·郭，N·莱温科娃，N·图，J·麦克维尔特，V·沃罗宁那，F·哈里斯，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US