用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，提供了一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，包括如下三条引物：序列表中序列1所示的上游引物1，序列表中序列2所示的上游引物2和序列表中序列3所示的上游引物3。本发明专利技术还提供了含有上述引物组合的试剂盒，及上述引物组合和试剂盒的应用。应用本发明专利技术提供的引物组合进行西瓜枯萎病抗性基因型的检测，操作流程全自动，降低了人为误差，分析通量高；应用于西瓜枯萎病抗性基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速西瓜抗病性状向优异骨干自交系的转育。

【技术实现步骤摘要】
用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合及其应用
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR竞争性等位基因特异性PCR)标记引物组合及其应用。
技术介绍
西瓜枯萎病是导致全球西瓜产量和品质降低的最严重障碍。迄今为止没有一种化学农药可以有效控制枯萎病的发生。生产上主要靠嫁接栽培措施进行有效防治，但易降低西瓜品质。因此，选育抗枯萎病品种是有效控制西瓜枯萎病最安全、经济的途径。目前，野生西瓜材料中存在多个抗源，而利用野生西瓜回交选育又容易出现连锁累赘，且栽培西瓜与野生西瓜抗性机制不同，所以，运用来源于栽培西瓜的抗性基因进行抗病转育是目前常规育种的主要手段。但大多数适宜我国保护地栽培的优质西瓜品种尚未聚合枯萎病抗性，究其原因，主要是由于缺乏高效的分子标记辅助育种技术手段，育种效率较低。因此开发栽培西瓜抗枯萎病基因连锁标记，将有利于高效改良栽培西瓜的枯萎病抗性，为西瓜抗病分子育种提供技术支撑。育种实践证明，针对目标基因的关键突变位点开发的功能型分子标记是分子标记辅助转育西瓜枯萎病抗性性状的前提条件。本实验室基于西瓜抗枯萎病基因Fo-1连锁的SNP位点开发了dCAPS标记，并获得了国家专利技术专利(专利号：ZL201310052303.3)。但上述标记需要对PCR产物进行酶切，并利用琼脂糖凝胶对目标片段进行分离检测等步骤，过程较为繁琐，造成这些标记在西瓜枯萎病抗性分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合及其应用。一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记核心引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，所述KASP标记核心引物组合包括如下三条引物：上游引物1的核心序列：5’-GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTT-3’；上游引物2的核心序列：5’-GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTA-3’；序列表中序列3所示的下游引物：5’-GTTGCGCTTTTTTGAGCGACGAAATAAATTCTTGC-3’。一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，所述KASP标记引物组合包括如下三条引物：序列表中序列1所示的上游引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTT-3’；序列表中序列2所示的上游引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTA-3’；序列表中序列3所示的下游引物：5’-GTTGCGCTTTTTTGAGCGACGAAATAAATTCTTGC-3’。一种用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，所述试剂盒含有所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合。作为优选的实施方式，所述试剂盒还包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶和dNTP；所述荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；所述荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；所述淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；所述淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。上述用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者上述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒在如下任一中的应用：(1)检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型；(2)培育具有西瓜枯萎病抗性的新材料；其中，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因。一种检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型的方法，所述西瓜枯萎病抗性的基因为Fo-1基因，所述方法包括如下步骤：以待测西瓜的基因组DNA为模板，采用上述用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者权上述用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行PCR扩增，将所得扩增产物进行荧光信号扫描，采用Kraken软件对扫描数据进行分析，根据分析结果按照如下方式确定所述待测西瓜的Fo-1基因的基因型：若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现红色，则所述待测西瓜的Fo-1基因的基因型为FoFo；若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现蓝色，则所述待测西瓜的Fo-1基因的基因型为fofo；若所述待测西瓜的扩增产物的荧光信号数据经Kraken软件分析在所得分型聚类图中呈现绿色，则所述待测西瓜的Fo-1基因的基因型为Fofo。作为优选的实施方式，所述PCR扩增反应的反应程序为：阶段1：94℃预变性15min；阶段2：94℃20s；61-55℃1min，共循环10次，每个循环降0.6℃；阶段3：94℃20s，55℃1min，共循环26次。一种培育具有西瓜枯萎病抗性的新材料的方法，包括：以感枯萎病、品质优良材料为受体亲本P1，与具有抗枯萎病基因、品质一般的供体亲本P2配制F1代杂交组合；再以受体亲本P1作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代回交分离群体；对所述BC1F1代回交分离群体，采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为FoFo的单株继续回交，获得BC2F1代回交分离群体；对所述BC2F1代回交分离群体，采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为FoFo的单株，继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体；对BCnF1代回交分离群体，继续采用权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒进行基因型检测，选取基因型为FoFo的单株自交，获得纯合抗枯萎病株系。作为优选的实施方式，所述n为3-8的整数，优选为4。本专利技术的有益效果如下：1、应用本专利技术提供的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，进行西瓜枯萎病抗性基因型的检测，操作流程全自动，降低了人为误差，分析通量高，非常适合大量样品同时检测。2、本专利技术提供的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合应用于西瓜枯萎病抗性基因的转育，可以大大节约时间和人工成本，提高分子标记辅助选择的育种效率，加速西瓜抗病性状向优异骨干自交系的转育。本专利技术的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。附图说明图1为实施例3中利用KASP标记引物组合检测西瓜Fo-1基因的基因型的96孔样品板SNP分型结果示意图。图中，黑色表示空白对照，红色为T:T，绿色为TA，蓝色为A:A。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的实施方式作进一步地详细描述。应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记核心引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo‑1基因，其特征在于：所述KASP标记核心引物组合包括如下三条引物：上游引物1的核心序列：5’‑GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTT‑3’；上游引物2的核心序列：5’‑GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTA‑3’；序列表中序列3所示的下游引物：5’‑GTTGCGCTTTTTTGAGCGACGAAATAAATTCTTGC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记核心引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，其特征在于：所述KASP标记核心引物组合包括如下三条引物：上游引物1的核心序列：5’-GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTT-3’；上游引物2的核心序列：5’-GCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTA-3’；序列表中序列3所示的下游引物：5’-GTTGCGCTTTTTTGAGCGACGAAATAAATTCTTGC-3’。2.一种用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，其特征在于：所述KASP标记引物组合包括如下三条引物：序列表中序列1所示的上游引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTT-3’；序列表中序列2所示的上游引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCGATAGAGAGGAGGACTTTGATGCCTA-3’；序列表中序列3所示的下游引物：5’-GTTGCGCTTTTTTGAGCGACGAAATAAATTCTTGC-3’。3.一种用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合。4.根据权利要求3所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A、淬灭探针B、高保真Taq酶和dNTP；所述荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；所述荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；所述淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；所述淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。5.权利要求2所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的KASP标记引物组合，或者权利要求3或4所述的用于检测西瓜枯萎病抗性的试剂盒在如下任一中的应用：(1)检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型；(2)培育具有西瓜枯萎病抗性的新材料；其中，所述西瓜枯萎病抗性基因为Fo-1基因。6.一种检测或辅助检测西瓜枯萎病抗性的基因型的方法，所述西瓜枯...

【专利技术属性】
技术研发人员：许勇，张海英，张洁，宫国义，郭绍贵，任毅，李茂营，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，京研益农北京种业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11