软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于软枣猕猴桃人工培育与分子生物学领域，具体涉及一种软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记及其应用。由于绝大多数软枣猕猴桃属于雌雄异株，雌株的经济价值明显高于雄株，而育种过程中实生苗童期过于漫长，需5～7年才能肉眼分辨出雌雄植株，因此如能对幼苗性别进行早期鉴定，则能大量节约育种成本。本发明专利技术提供了一种可用于软枣猕猴桃实生苗早期性别鉴定的分子标记，并在此基础上建立了一种软枣猕猴桃性别辅助选育试剂盒和一种软枣猕猴桃性别早期鉴定方法，通过在已知性别的95份软枣猕猴桃单株中进行检测，测试准确率可达94.7％，且本发明专利技术分子标记和方法通用性好、操作简单、稳定性好，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记及其应用
本专利技术属于软枣猕猴桃人工培育与分子生物学领域，具体涉及一种软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记及其应用。
技术介绍
世界猕猴桃产业的发展源于二十世纪初，而我国猕猴桃产业发展始于上世纪七十年代末期。早期栽培种植的品种主要来自于中华猕猴桃复合体(ActinidiachinensisPlanch.var.chinensis)中的中华猕猴桃原变种(Actinidia.chinensisPlanch.var.chinensis)和美味猕猴桃变种(A.chinensisPlanch.var.deliciosaA.Chev.)。软枣猕猴桃[A.arguta(Siebold&Zucc.)Planch.exMiq.]则是近年来发展最为迅速的新兴栽培品种。从形态上看，猕猴桃属植物的花类型为完全花，其中绝大多数种类属于功能性雌雄异株。猕猴桃属植物在实生育种过程中童期一般为5～7年，由于其特殊的遗传背景，后代常出现雄性多于雌性的现象。众所周知，作为果树类经济作物，其雌株的培育价值、经济价值和生产需求明显大于雄株，目前的人工育种工作也主要集中在雌性品种选育方面。因此，如能开发出用于幼苗早期性别鉴定的标记或方法，将会节约大量的人力、物力、时间等育种成本，加速育种进程。已有研究人员开展了类似的研究，如李旭等尝试利用生理生化鉴定等方法进行雌雄性别的鉴定(李旭，曹万万，姜丹等：基于形态观察法和生理生化法的软枣猕猴桃性别鉴别研究.北方园艺，2014(24):6-9.)；陈晓玲等利用同工酶分析法进行雌雄性别的鉴定(陈晓玲，梁红，朱东华：猕猴桃不同性别过氧化物酶及酯酶同工酶分析.农业与技术，2004,24(1):40-43.)，但上述方法其结果易受环境因素影响，准确性普遍较低。DNA分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础，是生物个体遗传变异的直接反映，利用其可以检测出生物个体之间核苷酸序列上的差异，为雌雄异株植物早期性别鉴定提供了新的途径。目前，已有一些关于猕猴桃属植物性别鉴定分子标记研究的报道。例如，SmX和SmY1是由Gill等通过集团分离分析法(BulkSegregantAnalysis，BSA)，利用二倍体中华猕猴桃实生群体开发的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregion)标记(GILLGP,HARVEYCF,GARDNERRC,etal.Developmentofsex-linkedPCRmarkersforgenderidentificationinActinidia.Theoretical&AppliedGenetics,1998,97(3):439-445.)，其中，SmX为雌性特异性标记，SmY1为雄性特异性标记；经测试，SmX仅能鉴定3个家系中的1个家系的性别，而不能用于另外2个家系，而SMY1的鉴定准确率达88％，能够有效区分中华猕猴桃性别。又例如，A001、A002和A003是张琼等在山梨猕猴桃(A.rufa)和中华猕猴桃的种间杂交F1代群体中，利用RAD-seq技术开发的SSR(simplesequencerepeats)标记(ZHANGQ,LIUCY,LIUYF,etal.High-densityinterspecificgeneticmapsofkiwifruitandtheidentificationofsex-specificmarkers.DNAResearch,2015,22(5):367-375.)，其可靠性在该研究中所用群体的174个F1代个体中得到验证；A001为雌性特异性标记，不仅在该F1代中表现出较高的准确性，而且能够鉴别另外3份山梨猕猴桃种质资源(‘山梨3’、‘山梨4’和‘山梨5’)的性别；A002和A003在雌性个体和雄性个体中分别扩增出大小不同的差异性片段，可用于鉴定植株性别；然而，测试发现仅有使用A003或者将A001和A002配合使用才可以鉴定研究中所用到的所有中华猕猴桃和山梨猕猴桃植株的性别。然而，目前研究发现的上述标记仅在报道所涉及研究材料样本中得到了验证，通过前期我们在软枣猕猴桃已知性别的品种或单株上进行测试，上述标记均不具有性别特异性。虽然关于软枣猕猴桃性别标记的研究也有报道(李旭，吴松权，姜明亮等：软枣猕猴桃性别相关的SRAP分子标记.江苏农业科学，2016,44(8):69-71.)，但相关研究中并未发现具有性别特异性的条带，且获得测试结果需要对多个并不稳定的多态性条带进行复杂的聚类分析，而所得聚类分析结果与样品的性别匹配率也仅能达到70％。不仅如此，上述测试方法通用性较差，测试过程操作复杂，所需人力和时间成本较高，且其结果稳定性易受试验操作影响，导致测试结果准确性较低。鉴于此，开发一种通用性好、操作简单、稳定性好、准确性高的针对软枣猕猴桃实生苗性别早期鉴定的分子标记对于软枣猕猴桃人工培育产业而言具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的且行之有效的软枣猕猴桃实生幼苗性别早期鉴定分子标记物。首先，本专利技术提供了一种软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记，所述分子标记的正向引物序列为：5′–TCTCGCCATCTTCAACCATTT–3′，反向引物序列为：5′–ATCTTGGCGTATCTCGGCTTT–3′。进一步地，利用所述分子标记的正向引物和反向引物对软枣猕猴桃基因组DNA进行扩增，其扩增产物长度为304bp，序列如下：TCTCGCCATCTTCAACCATTTCTCCTCGCCTGGTTATCCTCACGCAAATGGTCAAGTAGACGTCACCGATAGAACTATCCTAAGAACTCTAAAGGTGAGGTTAGAAAAGTCTAAGGGTGAATGGGCATAAGACCTTCAGATCATGCTATGGGATTACCACACGACAAGCAGAATTCCTACAGGTGAGATGCCGTATTCTATGGTATATAGGACAGAATCAATCATACTTGTGGAGATAGGAATGCCGAGCTTCAAGACCTCAAATTTTGACAAGGAGAACAACAAAGCCGAGATACGCCAAGAT。进一步地，本专利技术还涉及上述分子标记在软枣猕猴桃性别辅助选育中的应用。同时，本专利技术还涉及上述分子标记在猕猴桃性别辅助选育中的应用。此外，本专利技术还提供了一种软枣猕猴桃性别辅助选育试剂盒，所述试剂盒中含有上述分子标记的引物对。最后，本专利技术还提供了一种软枣猕猴桃性别早期鉴定方法，包括以下步骤：(1)软枣猕猴桃基因组DNA的提取：摘取软枣猕猴桃幼嫩叶片，置于液氮中冷冻之后，保存于-80℃冰箱中；取冷冻叶片组织100～200mg，装入放有1粒钢珠的2mlEP管中，再次于液氮中冷冻，用磨样机研磨至细粉状，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA，将模板DNA浓度稀释至20ng/μL，保存于-20℃冰箱中备用；(2)标记引物序列：正向引物序列：5′–TCTCGCCATCTTCAACCATTT–3′,反向引物序列：5′–ATCTTGGCGTATCTCGGCTTT–3′；(3)PCR反应体系：浓度为400nmol·L-1的正向引物——1μl，浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记，其特征在于，所述分子标记的正向引物序列为：5′–TCTCGCCATCTTCAACCATTT–3′，反向引物序列为：5′–ATCTTGGCGTATCTCGGCTTT–3′。

【技术特征摘要】
1.一种软枣猕猴桃幼苗性别早期鉴定分子标记，其特征在于，所述分子标记的正向引物序列为：5′–TCTCGCCATCTTCAACCATTT–3′，反向引物序列为：5′–ATCTTGGCGTATCTCGGCTTT–3′。2.如权利要求1所述的分子标记，利用所述正向引物和反向引物对软枣猕猴桃基因组DNA进行扩增，其扩增产物长度为304bp，序列如下：TCTCGCCATCTTCAACCATTTCTCCTCGCCTGGTTATCCTCACGCAAATGGTCAAGTAGACGTCACCGATAGAACTATCCTAAGAACTCTAAAGGTGAGGTTAGAAAAGTCTAAGGGTGAATGGGCATAAGACCTTCAGATCATGCTATGGGATTACCACACGACAAGCAGAATTCCTACAGGTGAGATGCCGTATTCTATGGTATATAGGACAGAATCAATCATACTTGTGGAGATAGGAATGCCGAGCTTCAAGACCTCAAATTTTGACAAGGAGAACAACAAAGCCGAGATACGCCAAGAT。3.如权利要求1所述的分子标记在软枣猕猴桃性别辅助选育中的应用。4.如权利要求1所述的分子标记在猕猴桃性别辅助选育中...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐秀娟，方金豹，郭丹丹，钟云鹏，孙雷明，林苗苗，王然，陈锦永，顾红，
申请(专利权)人：中国农业科学院郑州果树研究所，
类型：发明
国别省市：河南,41