一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物，其包括检测组合物1～检测组合物4中的至少一种；其中，检测组合物1为针对MTHFR C677T位点的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列；检测组合物2为针对MTHFR A1298C位点的SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示序列；检测组合物3为针对MTRR A66G位点的SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示序列；检测组合物4为针对MTR A2756G位点的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示序列。本发明专利技术还涉及一种含有上述检测组合物的试剂盒及检测方法。本发明专利技术采用免提取核酸直扩PCR技术，避免了DNA提取的繁琐步骤；克服了传统SNP分型一个管只能区分一个SNP位点多态性，创新性的使用多重标记的TaqMan‑MGB荧光探针，可以实现一管区分两个SNP位点多态性，其具有良好的特异性和快速的敏感性。

【技术实现步骤摘要】
一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于体外基因检测
，尤其涉及一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
叶酸，是一种水溶性维生素，人体自身无法合成，必须要通过外界摄取。虽然含叶酸的食物很多，但由于天然的叶酸极不稳定，受照射、加热易氧化，所以人体真正能从食物中获得的叶酸并不多。叶酸代谢能力是指叶酸被人体吸收与利用的能力，主要指参与同型半胱氨酸与蛋氨酸之间的相互转化过程。近年来对其代谢过程机制的研究发现，除了早产、流产先天性心脏病、神经管畸形、唐氏综合征与叶酸代谢有关外，其他的疾病也与叶酸的代谢异常相关，像是唇腭裂、妊娠晚期并发症、不同类型的神经和精神疾病、骨质疏松征及大肠癌MTRR(A66G)等癌症，另外，许多文献报道，老年期痴呆症等有关脑病变疾病与叶酸的缺乏有着直接或者间接的关系，叶酸缺乏还可能引起妊娠毒血症、坏血病、寄生虫病和类风湿性关节炎等多种疾病，以及其他诸如舌炎、腹泻、生长不良、精神萎缩和智力退化等症状。叶酸可引起发癌细胞凋亡，对癌细胞的基因表达有一定影响，故属于一种天然抗癌维生素。而叶酸补充不足，将会诱发心梗、脑梗等心脑血管疾病，同时，也会增加患各项肿瘤的风险。人与人之间因基因不同，对叶酸的代谢吸收能力也不同。通过此项基因检测，可了解自身的叶酸代谢能力，实现个体化补充叶酸，降低相关疾病的发病风险。目前研究较为成熟的有四氢叶酸还原酶(MTHFR)的C677T和A1298C位点，蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)上的A66G位点和MTRA2756G位点。MTHFR催化5,10-亚甲基四氢叶酸生成5-甲基四氢叶酸，后者是同型半胱氨酸(HCY)代谢产生蛋氨酸的一碳单位供体。C677T位点的基因多态性会导致丙氨酸被缬氨酸代替，这会导致酶活性下降，产生中度的高同型半胱氨酸血症(HHCY)，也会降低血液中叶酸的含量。全基因组联合会(GWASs)已经证实了C667位点基因型与健康人群血液中的HCY水平相关。进一步的研究表明，A1298C和C677T两个位点的双重突变会导致酶活更严重降低。MTRR是HCY代谢中另一种重要的酶，它在维生素B12的参与下催化HCY形成蛋氨酸。该基因最常见的突变位置为66处的A突变为G，导致酶活下降，HHCY风险上升，而MTR基因A2756G多态性与高甘油三酯对GGT水平升高具有交互作用。对于单基因位点SNP分型方法主要有：PCR-RFLP、PCR-芯片杂交法、一代DNA测序法和TaqManMGB基因分型法。PCR-RFLP主要依赖于靶标的限制性酶切位点，实验难度增大，同时后续的电泳分析容易引起实验室污染，无法大规模临床开展。PCR-芯片杂交法是将PCR技术与基因芯片技术结合使用的，同样有步骤复杂和实验室交叉污染的风险，影响检测结果判读，一代测序是基因检测的金标准，但是其操作流程过长，成本过高，同时仪器昂贵也难以适合在医院大规模开展。TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变(SNP)。上述几种主流方法仍不能解决下述两个问题：1)唾液或者血样样本需要复杂核酸提取和纯化步骤；2)在一管中实现多点SNP分型检测。目前，针对一种一管式直扩型MTHFR和或MTRR及MTR基因多态性的检测试剂盒和检测方法未见报道。
技术实现思路
为了于克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物、检测试剂盒及检测方法，上述检测可在一个反应管中进行，其敏感性好、特异性高、准确可靠、核酸免提取、能快速方便地实现一管检测双位点。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物，其包括检测组合物1～检测组合物4中的至少一种；其中，所述检测组合物1为针对MTHFRC677T位点的SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示序列的引物和SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示序列的探针；所述检测组合物2为针对MTHFRA1298C位点的SEQIDNO.5～SEQIDNO.6所示序列的引物和SEQIDNO.7～SEQIDNO.8所示序列的探针；所述检测组合物3为针对MTRRA66G位点的SEQIDNO.9～SEQIDNO.10所示序列的引物和SEQIDNO.11～SEQIDNO.12所示序列的探针；所述检测组合物4为针对MTRA2756G位点的SEQIDNO.13～SEQIDNO.14所示序列的引物和SEQIDNO.15～SEQIDNO.16所示序列的探针。进一步地，所述检测组合物包括检测组合物1和检测组合物2。进一步地，所述检测组合物包括检测组合物3和检测组合物4。进一步地，所述检测组合物包括检测组合物1、检测组合物2、检测组合物3和检测组合物4。进一步地，所述探针的5'端标记有报告荧光染料，3'端标记有淬灭荧光染料；所述报告荧光染料选自FAM、VIC、ROX、CY5；所述淬灭荧光染料选自BHQ、TAMRA、MGB。上述引物和探针的序列具体如下：表1引物和探针序列进一步地，由表1可知，C677T的野生型探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；C677T的突变型探针5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；A1298C的野生型探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3"端标记有淬灭荧光染料BHQ；A1298C的突变型探针5'端标记有报告荧光染料CY5，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；A66G的野生型探针5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；A66G的突变型探针5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；A2756G的野生型探针5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ；A2756G的突变型探针5'端标记有报告荧光染料CY5，3'端标记有淬灭荧光染料BHQ。本专利技术的第二个目的是提供一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测试剂盒，其包括任一上述的检测组合物。更优选为包括检测组合物1和检测组合物2，或检测组合物3和检测组合物4，或检测组合物1、检测组合物2、检测组合物3和检测组合物4。进一步地，所述试剂盒还包括MTHFRC677T和A1298C联合检测反应液、MTRRA66G和MTRA2756G联合检测反应液中的至少一种；其中，所述MTHFRC677T和A1298C联合检测反应液还包括改良型HotStarTaq酶、直扩PCR扩增缓冲液、直扩及稳定试剂；所述MTRRA66G和MTRA2756G联合检测反应液还包括改良型HotStarTaq酶、直扩PCR扩增缓冲液、直扩及稳定试剂。更进一步地，所述试剂盒还包括MTHFRC677T和A1298C联合检测反应液以及MTRRA66G和MTRA2756G联合检测反应液。进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品采用人基因组作为阳性对照，阴性对照品采用DEPCH2O。进一步地，所述直扩及稳定试剂包括：Tris-HCl：25mm-100mm；EDTA(乙二胺四乙酸)：1m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物，其特征在于，包括检测组合物1～检测组合物4中的至少一种；其中，所述检测组合物1为针对MTHFR C677T位点的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示序列的引物和SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示序列的探针；所述检测组合物2为针对MTHFR A1298C位点的SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示序列的引物和SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示序列的探针；所述检测组合物3为针对MTRR A66G位点的SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示序列的引物和SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示序列的探针；所述检测组合物4为针对MTR A2756G位点的SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.14所示序列的引物和SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示序列的探针。

【技术特征摘要】
1.一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测组合物，其特征在于，包括检测组合物1～检测组合物4中的至少一种；其中，所述检测组合物1为针对MTHFRC677T位点的SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示序列的引物和SEQIDNO.3～SEQIDNO.4所示序列的探针；所述检测组合物2为针对MTHFRA1298C位点的SEQIDNO.5～SEQIDNO.6所示序列的引物和SEQIDNO.7～SEQIDNO.8所示序列的探针；所述检测组合物3为针对MTRRA66G位点的SEQIDNO.9～SEQIDNO.10所示序列的引物和SEQIDNO.11～SEQIDNO.12所示序列的探针；所述检测组合物4为针对MTRA2756G位点的SEQIDNO.13～SEQIDNO.14所示序列的引物和SEQIDNO.15～SEQIDNO.16所示序列的探针。2.根据权利要求1所述的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包括检测组合物1和检测组合物2；或者包括检测组合物3和检测组合物4；或者包括检测组合物1、检测组合物2、检测组合物3和检测组合物4。3.根据权利要求1所述的检测组合物，其特征在于，所述探针的5'端标记有报告荧光染料，3'端标记有淬灭荧光染料；所述报告荧光染料选自FAM、VIC、ROX、CY5；所述淬灭荧光染料选自BHQ、TAMRA、MGB。4.一种直扩型MTHFR和/或MTRR及MTR基因多态性的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～3中任一项所述的检测组合物。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括MTHFRC677T和A1298C联合检测反应液、MTRRA66G和MTRA2756G联合检测反应液中的至少一种；其中，所述MTHFRC677T和A1298C联合检测反应液包括改良型HotStarTaq酶、直扩PCR扩增缓冲液、直扩及稳定试剂；所述MTRRA66G和MTRA2756G联合检测反应液包括改良型HotStarTaq酶、直扩PCR扩增缓冲液、直扩及稳定试剂；所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品采用人基因组；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘荣兵，徐赛涛，李杨，
申请(专利权)人：上海酷乐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31