一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗，非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被的非洲猪瘟的mRNA；非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的制备方法为将重组K205R‑IRES‑A104R‑IRES‑E183L基因连接至pMD19‑T载体，构成亲本pMD19‑K205R‑IRES‑A104R‑IRES‑E183L质粒；将亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；将目的片段进行体外转录即得mRNA。本发明专利技术非洲猪瘟mRNA疫苗，填补现有的空白区域、用于预防ASFV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的猪的一种病毒性疾病，是一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此我国将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病之一。ASFV主要在巨噬细胞的细胞质中复制，并且是非洲猪瘟病毒科中唯一成员，也是唯一由节肢动物传播的DNA病毒。2018年8月2日经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市发生第一例非洲猪瘟疫情，截至2018年11月23日共发生了74起非洲猪瘟疫情，全国累计扑杀生猪60万头，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。K205R基因在病毒感染猪4h时表达，能抑制INF-β的表达，表达的蛋白pK205R能在猪中引起强烈的抗体反应；A104R基因表达蛋白为组蛋白类似蛋白，能启动强烈的抗体反应；(Lokhandwala,Shehnazetal.“Adenovirus-vectorednovelAfricanSwineFeverVirusantigenselicitrobustimmuneresponsesinswine”PloSonevol.12,5e0177007.8May.2017,doi:10.1371/journal.pone.0177007)；E183L基因合成的P54蛋白是ASFV的免疫显性结构病毒抗原。因此，可以针对上述基因开发预防非洲猪瘟的疫苗。目前还没有非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的研制，因此开发一种mRNA疫苗，用于预防ASFV感染。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)目前还没有非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的研制；(2)DNA疫苗不能完全排除少数质粒DNA插入到染色体上引起突变的可能性；(3)一个或两个非洲猪瘟病毒抗原构建的DNA疫苗并不能诱导较高免疫保护。解决上述技术问题的意义：本专利技术填补目前非洲猪瘟病毒mRNA疫苗的空白；本专利技术最关键的部分就是进行体外转录获得mRNA分子，并且在大量生产mRNA疫苗过程中，需要确定mRNA的核糖核苷酸序列即可进行大规模的生产、复制；本专利技术中mRNA作为疫苗分子相对于DNA作为疫苗分子有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、转录让突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能；本专利技术含有三个非洲猪瘟病毒抗原的mRNA能提供较高的免疫保护。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种非洲猪瘟的合成基因、建立方法以及mRNA疫苗。本专利技术是这样实现的，一种非洲猪瘟病毒合成基因，所述非洲猪瘟病毒合成基因为K205R-IRES-A104R-IRES-E183L，序列为SEQIDNO：1。本专利技术的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法包括：步骤一：合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，将合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段用引物P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因；步骤二：将重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因连接至pMD19-T载体，构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；步骤三：将上述亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；步骤四：将上述目的片段进行体外转录即得合成基因。进一步，所述步骤二中，优选的重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因为：将T7启动子、限制性酶切位点BamHⅠ和限制性酶切位点XhoⅠ重组到K205R-IRES-A104R-IRES-E183L的基因。进一步，所述步骤三具体包括：将亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段；将上述测序正确的大肠杆菌接入含50μg/mlkana的LB液体培养基中，37℃，300rpm过夜培养；将过夜培养的大肠杆菌采用无内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提，抽提出的质粒即为克隆质粒。进一步，所述步骤一具体包括：K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段中三基因K205R、A104R和E183L由IRES链接；IRES能招募核糖体对合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因进行翻译；IRES与外源cDNA融合，IRES能独立地起始翻译。本专利技术的另一目的在于提供一种非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，所述的非洲猪瘟病毒mRNA疫苗，含有包被所述的非洲猪瘟病毒合成基因。具体包括：合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→利用P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因→连接至pMD19-T载体→构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒→转化进感受态细胞进行扩增→提取目的片段K205R-IRES-A104R-IRES-E183L(合成这个基因通过上述步骤进行扩增，也就是增值，低成本获得更多的目的片段/基因)基因→将提取的目的片段进行体外转录得mRNA(进行上述操作所需要得到的最终结果)→mRNA包被，得mRNA疫苗。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术提供一种非洲猪瘟mRNA疫苗，填补现有的空白区域。本专利技术的mRNA疫苗用于预防ASFV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。本专利技术的mRNA疫苗相对于DNA疫苗有突出的优点：它不需要任何的核定位信号、转录让突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能；它可以在胞质中直接翻译，无需转运至核内。本专利技术的mRNA疫苗相对于传统疫苗有突出的优点：大多数传统疫苗是由一种病毒或其他病原体的灭活形式组成的，这些疫苗通常需要很长时间来生产，并不总是引起强烈的免疫反应；mRNA疫苗能快速生产，能诱导宿主细胞产生很多mRNA编码的蛋白质的副本，这会比把蛋白质接种到体内引起更强烈的反应。附图说明图1是本专利技术实施例提供的非洲猪瘟病毒合成基因建立方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒构建示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供的非洲猪瘟病毒mR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒合成基因，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒合成基因为K205R‑IRES‑A104R‑IRES‑E 183L，序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒合成基因，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒合成基因为K205R-IRES-A104R-IRES-E183L，序列为SEQIDNO：1。2.一种如权利要求1所述非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法包括：步骤一：合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段，将合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段用引物P1、P2进行扩增，构成重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因；步骤二：将重组K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因连接至pMD19-T载体，构成亲本pMD19-K205R-IRES-A104R-IRES-E183L质粒；步骤三：将上述亲本质粒转化感受态细胞，扩增后提取质粒即克隆质粒，在克隆质粒中提取目的片段；步骤四：将上述目的片段进行体外转录即得合成基因K205R-IRES-A104R-IRES-E183L。3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒合成基因的建立方法，其特征在于，其特征在于，所述步骤一具体包括：K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因片段中三基因K205R、A104R和E183L由IRES链接；IRES能招募核糖体对合成K205R-IRES-A104R-IRES-E183L基因进行翻译；IRES与外源cDNA融合，IRES能独立地起始翻译。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，朱玲，孙贤刚，李飞，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51