一种GGT抗体免疫纳米磁珠及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种GGT抗体免疫纳米磁珠及其制备方法和用途，GGT抗体免疫纳米磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为高聚物脂质体，最外层为GGT抗体；所述高聚物脂质体为羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇的混合物；本申请将GGT抗体接在Fe3O4纳米磁珠上，通过绿色荧光GGT抗体结合在胶质瘤表面富集血液中的胶质瘤细胞，后续的检测流程同EpCAM试剂盒检测，通过胶质瘤细胞包面特意表达GGT蛋白表达来确定胶质瘤细胞，在临床上合理并且实用，通过CTC分析可以通过动态检测肿瘤细胞的变化，实时动态的反映患者的治疗状况及疾病进程，为目前的肿瘤治疗监测提供无创精准的补充。

【技术实现步骤摘要】
一种GGT抗体免疫纳米磁珠及其制备方法和应用
本专利技术涉及免疫纳米磁珠
，具体说是一种GGT抗体免疫纳米磁珠及其制备方法和应用。
技术介绍
脑胶质瘤是人体十大恶性肿瘤之一，也是最常见的中枢神经系统肿瘤，其中多行性胶质母细胞瘤GBM最常见，并且具有侵袭性强、致死率高、易复发等特点，目前临床上常见的问题是部分病人放化疗完成后出现的放化疗反应的假性进展和胶质瘤的真性复发难以鉴别，早期发现和诊断复发病灶及早再次手术或延长化疗周期是提高GBM病人生存期的关键技术，更是精准医疗的重大需求。循环肿瘤细胞CTCs是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。CTCs检测被称为液体活检，虽然具有可重复检测、无创伤等优点，但是相当具有挑战性，价格昂贵，痛苦，存在潜在危险，外周血液中的循环肿瘤细胞检测作为一种可靠无创的方式，具有良好的前景，但是目前由美国FDA批准临床使用的商业化的CTC技术(CellSearch,JanssenDiagnostics)主要基于对EpCAM的检测。但是这些检测技术对于不表达表面标记物EpCAM的脑胶质瘤细胞是无效的，并且由于上皮间质化过程也会导致细胞表面标记物的蛋白表达变化，从而影响其准确性。另一方面，CTC在人体中的含量极其稀有，每千亿个血细胞中只有1～10个CTC，这为CTC的检测分析带来了巨大的挑战，从胶质瘤病人1ml血细胞中分辨出个位数的CTC其难度极大，因此CTC分析需要高灵敏度富集技术，最近的进展表明膜结合蛋白酶G-谷氨酰转肽酶(GGT)可作为可激活荧光探针的靶标。这种蛋白在胶质瘤细胞过度表达，而且和胶质瘤恶性程度呈正相关，但在正常脑组织中表达很低。因此，临床上亟需设计一种不依赖于上皮细胞癌细胞表面标记物的快速检测系统，满足临床对GBMCTC无创液体活检诊断和复发监测的需要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种GGT抗体免疫纳米磁珠及其制备方法和应用。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种GGT抗体免疫纳米磁珠，所述GGT抗体免疫纳米磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为高聚物脂质体，最外层为GGT抗体；所述高聚物脂质体为羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇的混合物。优选的，羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇、磁性材料Fe3O4和GGT抗体的质量比为15～20：12～16：36～48：1。优选的，GGT抗体免疫纳米磁珠的平均粒径为100～200nm。优选的，羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、胆固醇、磁性材料Fe3O4和GGT抗体的质量比为20：15：42：1。本专利技术还包括一种GGT抗体免疫纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：①将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(HQCMC)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇分别溶于二氯甲烷中，备用；②将N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCI)分别溶于双蒸水中摇匀，备用；③分别吸取步骤①中配制的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇的二氯甲烷溶液，加入烧瓶中，置于2～6℃的环境中备用；将油溶性Fe3O4磁珠加入至烧瓶中，然后向烧瓶中加入pH7.2～7.4磷酸盐缓冲溶液，摇晃均匀，然后将烧瓶置于超声波细胞粉碎机中超声后，除去二氯甲烷，然后向烧瓶中加入步骤②配制的N-N-羟基琥珀酰亚胺双蒸水和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐双蒸水，混匀，然后向烧瓶中加入GGT抗体，在2～6℃下反应10～15小时，得到GGT抗体免疫纳米磁珠。优选的，步骤①中羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇与二氯甲烷的质量体积比均为3～5mg：1mL。优选的，步骤②中N-N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与双蒸水的质量体积比为1～3mg：1mL。优选的GGT抗体免疫纳米磁珠的制备方法包括以下步骤：①将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇分别溶于二氯甲烷中，备用；其中羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇与二氯甲烷的质量体积比均为3～5mg：1mL；②将N-N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分别溶于双蒸水中摇匀，备用；其中N-N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与双蒸水的质量体积比为1～3mg：1mL；③分别吸取步骤①中配制的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇的二氯甲烷溶液，加入烧瓶中，置于2～6℃的环境中备用；将油溶性Fe3O4磁珠加入至烧瓶中，然后向烧瓶中加入pH7.2～7.4磷酸盐缓冲溶液，摇晃均匀，然后将烧瓶置于超声波细胞粉碎机中超声后，除去二氯甲烷，然后向烧瓶中加入步骤②配制的N-N-羟基琥珀酰亚胺双蒸水溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐双蒸水溶液，混匀，然后向烧瓶中加入GGT抗体，得到混合液，将混合液在2～6℃下反应10～15小时，得到GGT抗体免疫纳米磁珠；混合液中羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、油溶性Fe3O4磁珠、N-N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和GGT抗体的质量比为15～20：12～16：12～16：36～48：140～200：240～320：1。本专利技术还包括一种GGT抗体免疫纳米磁珠的应用，快速富集胶质细胞瘤循环肿瘤细胞。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术的GGT抗体免疫纳米磁珠具有明显的核壳结构，油溶性磁颗粒包裹在高聚物脂质体的内核中，高聚物脂质体的外层为GGT抗体，高聚物脂质体的厚度为2～7nm，其组成主要为羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇的共混物，含有氨基、羧基和季铵盐基团，具有较高的正电性，并且具有很好的生物相容性，通过与生物活性物质中的配基偶联，能识别并结合相应的胶质瘤细胞抗原，在外加磁场中实现胶质瘤细胞的快速富集，具有广阔的应用前景；本申请将GGT抗体接在Fe3O4纳米磁珠上，通过绿色荧光GGT抗体(替代EpCAM)结合在胶质瘤表面富集血液中的胶质瘤细胞(循环肿瘤细胞)，后续的检测流程同EpCAM试剂盒检测，通过胶质瘤细胞包面特意表达GGT蛋白表达来确定胶质瘤细胞，在临床上合理并且实用，通过CTC分析可以通过动态检测肿瘤细胞的变化，实时动态的反映患者的治疗状况及疾病进程，为目前的肿瘤治疗监测提供无创精准的补充。本申请的GGT抗体免疫纳米磁珠，在检测胶质瘤细胞时不依赖于上皮细胞癌细胞表面标记物，能实现胶质瘤细胞的快速检测系统，满足临床对GBMCTC无创液体活检诊断和复发监测的需要。附图说明图1为实施例5的GGT抗体免疫磁珠的粒径检测结果图；图2为实施例5的GGT抗体免疫磁珠的电位检测结果图；图3为实施例5的GGT抗体免疫磁珠的磁强度检测结果图；图4为实施例5的GGT抗体免疫磁珠的原子力显微镜图；图5为部分胶质细胞瘤病人血液典型的CTC表现示意图；图6为非配对t检测分布图；图7为ROC曲线分析法评估CTCs在鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种GGT抗体免疫纳米磁珠，其特征在于：所述GGT抗体免疫纳米磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为高聚物脂质体，最外层为GGT抗体；所述高聚物脂质体为羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种GGT抗体免疫纳米磁珠，其特征在于：所述GGT抗体免疫纳米磁珠为核壳型结构，内核为磁性材料Fe3O4，中间层为高聚物脂质体，最外层为GGT抗体；所述高聚物脂质体为羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇的混合物。2.根据权利要求1所述的一种GGT抗体免疫纳米磁珠，其特征在于：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和胆固醇、磁性材料Fe3O4和GGT抗体的质量比为15~20：12~16：36~48：1。3.根据权利要求2所述的一种GGT抗体免疫纳米磁珠，其特征在于：羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、胆固醇、磁性材料Fe3O4和GGT抗体的质量比为20：15：42：1。4.一种GGT抗体免疫纳米磁珠的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：①将羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇分别溶于二氯甲烷中，备用；②将N-N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐分别溶于双蒸水中摇匀，备用；③分别吸取步骤①中配制的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇的二氯甲烷溶液，加入烧瓶中，置于2~6℃的环境中备用；将油溶性Fe3O4磁珠加入至烧瓶中，然后向烧瓶中加入pH7.2~7.4磷酸盐缓冲溶液，摇晃均匀，然后将烧瓶置于超声波细胞粉碎机中超声后，除去二氯甲烷，然后向烧瓶中加入步骤②配制的N-N-羟基琥珀酰亚胺双蒸水和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐双蒸水，混匀，然后向烧瓶中加入GGT抗体，在2~6℃下反应10~15小时，得到GGT抗体免疫纳米磁珠。5.根据权利要求4所述的一种GGT抗体免疫纳米磁珠的制备方法，其特征在于：步骤①中羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱和胆固醇与二氯甲烷的质量体积比均为3~5mg：1mL。6.根据权利要求4所述的一种GGT抗体免...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘英超，梅胜兰，许尚臣，兰川金，
申请(专利权)人：山东省立医院，
类型：发明
国别省市：山东,37