可大幅提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法技术

本发明专利技术公开了可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法，包括以下步骤：1）样品的取材；2）清洗；3）固定；4）脱水；5）乙醇置换；6）干燥；7）粘样并镀膜；8）样品的观察。本发明专利技术通过扫描电镜观察得到完整的具有较高分辨率的表面光滑的稻飞虱唾液鞘图像。本发明专利技术通过改进稻飞虱唾液鞘的扫描电镜样品制备中的多个关键环节，解决了稻飞虱唾液鞘扫描电镜观察中易出现的看不到样品、干裂、缺损、断裂、细节不清晰等问题，有助于减少相关实验人员的工作量，提高效率。

【技术实现步骤摘要】
可大幅提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法
本专利技术涉及农业科学
，具体涉及可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法。
技术介绍
稻飞虱是一类重要的农业害虫属于同翅目，飞虱科，包括褐飞虱Nilaparvatalugens白背飞虱Sogatellafurcifera(Horváth)和灰飞虱Laodelphaxstriatellus(Fallén)。三种稻飞虱都通过直接刺吸水稻危害，或者传播和诱发水稻病害，每年给我国的水稻产量造成极大地损失。正是由于稻飞虱巨大的危害性，国家多年来一直大量拨款用于防治三种稻飞虱，食性是研究稻飞虱危害水稻的非常重要的环节。稻飞虱主要通过刺吸式口器刺吸水稻茎叶组织液，口针穿刺进入水稻组织中，分泌唾液蛋白，进而形成一个类似管状结果的蛋白鞘，故名唾液鞘。稻飞虱通过唾液鞘不断的将水稻茎叶深处的营养物质吸收进体内；因此唾液鞘的长短乃至整个外部形态，都是我们科研人员研究稻飞虱食性的关键指标。然而由于稻飞虱本身体积比大米粒还小，唾液鞘则更小，非常难于观察，我们借助于扫描电子显微镜才可以观察到。但是扫面电子显微镜对唾液鞘样品的处理有很高的要求，科研人员经过前期的研究，提出了制备稻飞虱唾液鞘电镜样品的方法，但是，在科研人员的实际操作中，还有许多不完善的地方，导致观察到的稻飞虱唾液鞘扫描样品图片出现看不到样品、干裂、缺损、断裂、细节不清晰等问题，严重影响了我们防治稻飞虱科学研究的进展。我们根据自己实验中的经验，经过不懈的探索，形成了一整套稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品的制备方法，这非常有助于我们科研工作人员加快实验进度，借助于对稻飞虱食性的研究，更快的开发出防治三种稻飞虱的方法。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提供了可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法，包括以下步骤：1)样品的取材；取4-5龄稻飞虱若虫，并进行饲喂，并获得带有唾液鞘的parafilm膜；2)清洗：将带有唾液鞘的parafilm膜采用PBS缓冲液配制的乙醇溶液进行清洗；3)固定：将清洗完成的带有唾液鞘的parafilm膜用固定液进行固定，固定后，吸出固定液，加入PBS漂洗获得固定后的样品；4)脱水：将固定后的样品通过加入不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，样品在每个梯度的乙醇溶液停留5～10分钟获得脱水后的样品；5)乙醇置换：将脱水后的样品加入乙醇：醋酸异戊酯＝2～3:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯＝1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动从样品中置换乙醇；6)干燥：用滤纸轻轻吸去残留在步骤5)得到的样品表面的醋酸异戊酯，将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为40～60℃，干燥时间为2h，需严格控制时间；7)粘样并镀膜：导电双面胶粘到样品台上，然后将干燥后的样品粘到样品台上的导电双面胶上，然后利用离子溅射镀膜法给样品镀金膜；8)样品的观察：将步骤7)得到的含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄获得稻飞虱唾液鞘的扫描电镜图片。其中，所述步骤2)的PBS缓冲液配制的乙醇溶液的体积百分比浓度为75％。其中，所述步骤2)固定液为4％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合液或；所述步骤2)固定液为4％多聚甲醛和曲拉通X-100的混合液。其中，所述4％多聚甲醛和2.5％戊二醛体积比为1～3:1，所述4％多聚甲醛和曲拉通X-100的质量比为9～15:1。其中，所述步骤3)中的乙醇溶液浓度为30％～100％。有益效果：相对于现有技术，本专利技术具备以下优点：根据改进后的方法，可以解决稻飞虱唾液鞘扫描电镜照片中出现的看不到样品、干裂、缺损、断裂、细节不清晰等问题，形成完整的具有较高分辨率的表面光滑的稻飞虱唾液鞘图像，有助于稻飞虱取食和防治等相关研究的开展。附图说明图1稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是断裂的部分；图2稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示是干瘪倒伏的唾液鞘；图3稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是顶部干裂的部分；图4稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是顶部缺损塌陷的部分；图5稻飞虱唾液鞘电镜图，红色箭头指示的是烘干不当干裂的部分；图6稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的单支的稻飞虱唾液鞘(实施例1改进后)；图7稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例1改进后)；图8稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例2改进后)；图9稻飞虱唾液鞘电镜图，图片表示的双支的稻飞虱唾液鞘(实施例3改进后)；图10稻飞虱唾液鞘电镜图，其他人拍摄的稻飞虱唾液鞘电镜图，图片来源于著名SCI杂志PlantPhysiology：XinxinShangguan,JingZhang,BingfangLiu，YanZhao,HuiyingWang,ZhizhengWang,JianpingGuo,WeiweiRao,ShengliJing,WeiGuan,YinhuaMa,YanWu,LiangHu,RongzhiChen,BoDu,LiliZhu,DazhaoYu,andGuangcunHe(2018)Amucin-likeproteinofplanthopperisrequiredforfeedingandinducesimmunityresponseinplants.PlantPhysiology.Vol.176,pp.552–565。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的实施例进行详细说明，但是本专利技术可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。实施例11、取样：取20头左右4-5龄稻飞虱若虫，在25℃，相对湿度为60％，光周期为16:8(D：L)条件下，饲喂24h。以灰飞虱为例，在上述温湿条件下：取一个两端都开口直径2.5cm的玻璃管，一端封纱布，另一端封双层parafilm膜(两层膜内包含稻飞虱人工饲料)，玻璃管内放入稻飞虱。饲喂24h，揭开双层parafilm膜，即获得带有唾液鞘的parafilm膜；表1人工饲料中稻飞虱若虫数目、饲喂时间与能否观察到唾液鞘之间的关系：2、样品的清洁：将带有唾液鞘的parafilm膜，用PBS缓冲液(NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L，pH7.2～7.4)稀释的75％的乙醇溶液中，清洗1h，每15min更换一次清洗液。后置于PBS缓冲液中，再清洗2次，每次5min。3、样品的固定：将清洗后的带有唾液鞘的parafilm膜，用以下2种方式均可，需严格控制固定液比例和固定时间。表2稻飞虱唾液鞘固定液的配置比例固定液比例第一种：4％多聚甲醛：2.5％戊二醛1:1第二种：4％多聚甲醛：曲拉通X-1009:1当选择第一种固定液时4℃固定1h，当选择第二种固定液时4℃固定过夜。固定后，吸出固定液，加入磷酸缓冲液(PBS)漂洗1h，每20min换液一次。4、样品的脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）样品的取材：取4‑5龄稻飞虱若虫，并进行饲喂，并获得带有唾液鞘的parafilm膜；2）清洗：将带有唾液鞘的parafilm膜采用PBS缓冲配制的乙醇溶液进行清洗；3）固定：将清洗完成的带有唾液鞘的parafilm膜用固定液进行固定，固定后，吸出固定液，加入PBS漂洗获得固定后的样品；4）脱水：将固定后的样品通过加入不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，样品在每个梯度的乙醇溶液停留5~10分钟获得脱水后的样品；5）乙醇置换：将脱水后的样品加入乙醇：醋酸异戊酯=2~3:1的混合溶液，浸泡5‑10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯=1:1的混合溶液，浸泡5‑10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动从样品中置换乙醇；6）干燥：用滤纸轻轻吸去残留在步骤5）得到的样品表面的醋酸异戊酯，将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为40~60℃，干燥时间为1.5~2h，需严格控制时间；7）粘样并镀膜：导电双面胶粘到样品台上，然后将干燥后的样品粘到样品台上的导电双面胶上，然后利用离子溅射镀膜法给样品度金膜；8）样品的观察：将步骤7）得到的含有镀膜的样品的样品台，放入扫描电镜观察室进行观察，并对稻飞虱唾液鞘图片进行拍摄获得稻飞虱唾液鞘的扫描电镜图片。...

【技术特征摘要】
1.可大幅度提高稻飞虱唾液鞘扫描电镜样品质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）样品的取材：取4-5龄稻飞虱若虫，并进行饲喂，并获得带有唾液鞘的parafilm膜；2）清洗：将带有唾液鞘的parafilm膜采用PBS缓冲配制的乙醇溶液进行清洗；3）固定：将清洗完成的带有唾液鞘的parafilm膜用固定液进行固定，固定后，吸出固定液，加入PBS漂洗获得固定后的样品；4）脱水：将固定后的样品通过加入不同浓度的乙醇溶液进行梯度脱水，样品在每个梯度的乙醇溶液停留5~10分钟获得脱水后的样品；5）乙醇置换：将脱水后的样品加入乙醇：醋酸异戊酯=2~3:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；进而转移至乙醇：醋酸异戊酯=1:1的混合溶液，浸泡5-10min并轻轻摇动；最后转移至醋酸异戊酯溶液中浸泡10min并轻轻摇动从样品中置换乙醇；6）干燥：用滤纸轻轻吸去残留在步骤5）得到的样品表面的醋酸异戊酯，将带有唾液鞘的parafilm膜放入培养皿中，盖上培养皿盖子，在25℃条件下自然干燥24h，后转移至烘箱中，将温度设置为40~60℃，干燥时间为1.5~2h，需严格控制时间；7）粘样并镀膜：...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠佳菲，孙洋，刘宝生，方继朝，纪锐，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32