一种简便的细胞冻存和复苏方法技术

本发明专利技术公开了一种简便的细胞冻存和复苏方法，其中细胞冻存包括以下步骤：制备细胞悬液并将其离心，用细胞冻存液重悬细胞沉淀，然后全部转移到细胞冻存管中，封口膜封口，依次经预冷和冷冻后转移到超低温冰箱中保存；细胞复苏的方法包括以下步骤：从‑80℃超低温冰箱中取出细胞冻存管，在37‑40℃的水浴锅中摇动，冻存液完全融化后立即将细胞悬液转移到装有新鲜培养基的培养瓶中培养。本方法冻存细胞降低了对冻存条件的要求，在无液氮的条件下，仍可进行正常的细胞冻存与复苏，在不影响细胞活性的条件下保存时长可达9个月，能满足一般实验室对细胞冻存与复苏的要求。

【技术实现步骤摘要】
一种简便的细胞冻存和复苏方法
本专利技术属于细胞技术应用领域，具体涉及一种简便的细胞冻存和复苏方法。
技术介绍
细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病、保持健康的关键。目前，细胞培养技术已经涉及到病毒、肿瘤、药理及食品健康性研究等领域。细胞冻存和复苏是细胞培养的基础操作，现有冻存和复苏技术存在操作步骤多、冻存液成分复杂、对细胞损伤大及对保存条件要求高等问题，为了克服现有冻存及复苏方法存在的操作步骤多时间长、离心对细胞有损伤及保存条件高等问题，本专利技术公开了一种简便、高效的细胞冻存和复苏方法。
技术实现思路
本专利技术为了客服上述现有技术的不足，旨在提供一种简便的细胞冻存和复苏方法。本专利技术所公开的细胞冻存和复苏方法操作简单，合理有效，尤其解决了没有液氮条件时细胞冻存的问题。本专利技术简便的细胞冻存和复苏方法，包括如下步骤：步骤1：冻存1a、从培养箱中取出融合至80％以上的细胞，弃培养基，用预热到37℃的PBS缓冲液清洗细胞1-2次，弃全部PBS缓冲液；1b、向1a的细胞培养瓶中加胰蛋白酶(按25cm2的培养瓶中加0.5-1mL胰蛋白酶的比例添加)，消化细胞5-50s，然后弃胰蛋白酶；1c、向1b的细胞培养瓶中加入新鲜培养基，轻轻吹打，制备细胞悬液；1d、将1d获得的细胞悬液转移至离心管中，1000-1500r/min离心3-10min；1e、离心后弃上清，加适量细胞冻存液重悬细胞，然后将细胞悬液转移至细胞冻存管中；所述细胞冻存液包含85％-95％的胎牛血清和5％-15％的DMSO；细胞冻存液重悬细胞的用量为：每毫升冻存液重悬1×106-1×107个细胞；1f、将1e获得的装有细胞悬液的冻存管置于4℃的冰箱中预冷10-30min，然后转移至-20℃的冰箱中冷冻1-2h，最后将细胞冻存管转移至-80℃的超低温冰箱中长期保存。在不影响细胞活性的条件下保存时长可达9个月。步骤2：复苏2a、从-80℃取出冻存的细胞冻存管，立即置于已预热至37-40℃的水浴锅中，溶解过程不断摇动冻存管至固体完全溶解，以加快溶解速度；2b、迅速将溶解后的细胞悬液转移至装有适量新鲜培养基(每毫升复苏后的细胞悬液中加入3-8mL新鲜培养基)的培养瓶中，然后放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，24-48h大部分细胞贴壁，继续培养至48-72h，至细胞融合达90％以上后传代供细胞试验使用或传代后冻存。所述新鲜培养基含80-90％DMEM的高糖培养基和10-20％的胎牛血清。本专利技术公开的细胞冻存和复苏的方法与现有技术相比，其有益效果主要体现在：1、离心步骤少。对于体外生长的细胞而言，制备成细胞悬液后离心过程对其有一定的损伤，尤其刚复苏的细胞比较脆弱，离心过程对其损伤更大，本方法中细胞复苏后直接转移至培养瓶中培养，无需离心步骤；2、细胞冻存液成分简单，仅包含85％-95％的胎牛血清和5％-15％的DMSO，简化了细胞冻存工作；3、本方法冻存细胞降低了对冻存条件的要求，在无液氮的条件下，仍可进行正常的细胞冻存与复苏，在不影响细胞活性的条件下保存时长可达9个月，能满足一般实验室对细胞冻存与复苏的要求。附图说明图1是细胞冻存6个月、9个月后复苏密度、复苏24h和48h时的形态，其中左侧列为冻存6个月的细胞复苏形态、右侧列为冻存9个月的细胞复苏形态。图1中的细胞是在50×显微镜下观察到的冻存一定时间后复苏的细胞形态，从图中可以看出：冻存6个月的细胞密度大于冻存9个月的密度(密度取决于冻存时细胞悬液的密度，与冻存时长无关)，经过贴壁均可正常增殖。说明依照本专利技术技术方案冻存9个月的细胞可正常复苏。具体实施方式下面结合附图和具体的实施例对本专利技术技术方案作进一步分析说明。以下实施例中所述PBS缓冲液配制方法(1L配方)如下：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g，氯化钠(NaCl)：8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，浓盐酸调pH至7.4，定容到1L，即得pH7.4的PBS。实施例1：1、25cm2的培养瓶培养人胃上皮细胞(Ges-1)，融合至90％时从培养箱中取出，弃培养基，用预热到37℃的PBS2mL清洗细胞2次，然后弃PBS；2、向细胞培养瓶中加1mL胰蛋白酶，放平培养瓶至胰蛋白酶覆盖整个培养瓶底面，20s后弃胰蛋白酶；3、向培养瓶中加入含15％胎牛血清的新鲜培养基5mL，轻轻吹打，制备成细胞悬液；4、转移全部细胞悬液于离心管中1000r/min离心8min；5、离心后弃上清，向离心管中加入细胞冻存液，重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至细胞冻存管中，此细胞冻存液包含95％的胎牛血清和5％的DMSO；6、将装有细胞悬液的冻存管置于5℃的冰箱中预冷30min，然后转移至-20℃的冰箱中冷冻1h，最后将细胞冻存管转移至-80℃的超低温冰箱中保存6个月；人胃上皮细胞(Ges-1)的复苏：7、从-80℃的超低温冰箱取出冻存6个月的细胞冻存管，立即放入已经预热至39℃的水浴锅中，溶解过程中不断摇动冻存管至完全溶解，以加快溶解速度；8、迅速把溶解后的细胞悬液转移至装有5mL新鲜培养基的25cm2培养瓶中，新鲜培养基含10％的胎牛血清；9、左右轻轻摇匀，至培养基铺满瓶底面即可放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h大部分细胞贴壁，继续培养至48h，细胞融合超过80％(复苏细胞形态见图1左侧)。左右轻轻摇匀是指培养瓶的左、右侧一高一低摇动(以避免旋转摇动造成的细胞聚集、铺展不均匀等问题)，直至培养基铺满培养瓶底面即可放到培养箱中培养。实施例2：1、6孔板培养Ges-1，融合至90％以上时从培养箱中取出，弃培养基，用预热到37℃的PBS1mL清洗细胞1次，然后弃PBS；2、向孔中加0.5mL胰蛋白酶，放平6孔板至胰蛋白酶覆盖整个培养瓶底面，20s后弃胰蛋白酶；3、向孔中加入含10％胎牛血清的新鲜培养基3mL，轻轻吹打，制备成细胞悬液；4、转移全部细胞悬液于离心管中1500r/min离心5min；5、离心后弃上清，向离心管中加入细胞冻存液，重悬细胞沉淀，然后将细胞悬液转移至细胞冻存管中，此细胞冻存液包含90％的胎牛血清和10％的DMSO；6、将装有细胞悬液的冻存管置于5℃的冰箱中预冷20min，然后转移至-20℃的冰箱中冷冻2h，最后将细胞冻存管转移至-80℃的超低温冰箱中保存9个月；人胃上皮细胞(Ges-1)的复苏：7、从-80℃的超低温冰箱取出冻存9个月的细胞冻存管，立即放入已经预热至37℃的水浴锅中，溶解过程中不断摇动冻存管至完全溶解，以加快溶解速度；8、迅速把溶解后的细胞悬液转移至装有2mL新鲜培养基的6孔板中，新鲜培养基含15％的胎牛血清；9、左右轻轻摇匀，至培养基铺满瓶底面即可放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h大部分细胞贴壁，继续培养至48h，细胞融合超过80％。(复苏细胞形态见图1右侧)。左右轻轻摇匀是指培养瓶的左、右侧一高一低摇动(以避免旋转摇动造成的细胞聚集、铺展不均匀等问题)，直至培养基铺满培养瓶底面即可放到培养箱中培养。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简便的细胞冻存和复苏方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：冻存1a、从培养箱中取出融合至80％以上的细胞，弃培养基，用预热到37℃的PBS缓冲液清洗细胞1‑2次，弃全部PBS缓冲液；1b、向1a的细胞培养瓶中加胰蛋白酶，消化细胞5‑50s，然后弃胰蛋白酶；1c、向1b的细胞培养瓶中加入新鲜培养基，轻轻吹打，制备细胞悬液；1d、将1d获得的细胞悬液转移至离心管中，1000‑1500r/min离心3‑10min；1e、离心后弃上清，加细胞冻存液重悬细胞，然后将细胞悬液转移至细胞冻存管中；1f、将1e获得的装有细胞悬液的冻存管置于4℃的冰箱中预冷10‑30min，然后转移至‑20℃的冰箱中冷冻1‑2h，最后将细胞冻存管转移至‑80℃的超低温冰箱中长期保存；步骤2：复苏2a、从‑80℃取出冻存的细胞冻存管，立即置于已预热至37‑40℃的水浴锅中，溶解过程不断摇动冻存管至固体完全溶解，以加快溶解速度；2b、迅速将溶解后的细胞悬液转移至装有新鲜培养基的培养瓶中，然后放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，24‑48h大部分细胞贴壁，继续培养至48‑72h，至细胞融合达90％以上后传代供细胞试验使用或传代后冻存。...

【技术特征摘要】
1.一种简便的细胞冻存和复苏方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：冻存1a、从培养箱中取出融合至80％以上的细胞，弃培养基，用预热到37℃的PBS缓冲液清洗细胞1-2次，弃全部PBS缓冲液；1b、向1a的细胞培养瓶中加胰蛋白酶，消化细胞5-50s，然后弃胰蛋白酶；1c、向1b的细胞培养瓶中加入新鲜培养基，轻轻吹打，制备细胞悬液；1d、将1d获得的细胞悬液转移至离心管中，1000-1500r/min离心3-10min；1e、离心后弃上清，加细胞冻存液重悬细胞，然后将细胞悬液转移至细胞冻存管中；1f、将1e获得的装有细胞悬液的冻存管置于4℃的冰箱中预冷10-30min，然后转移至-20℃的冰箱中冷冻1-2h，最后将细胞冻存管转移至-80℃的超低温冰箱中长期保存；步骤2：复苏2a、从-80℃取出冻存的细胞冻存管，立即置于已预热至37-40℃的水浴锅中，溶解过程不断摇动冻存管至固体完全溶解，以加快...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴翠芳，刘国英，何宏魁，李静心，李安军，
申请(专利权)人：安徽古井贡酒股份有限公司，安徽瑞思威尔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34