一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，涉及基因工程及蛋白质改造技术领域。具体来说是一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体MutY257T，突变体MutY257T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。MutY257T可降解三七皂苷R1，产物为人参皂苷Rg1；但该突变体几乎不能降解三七皂苷R2。本发明专利技术的木糖苷酶突变体MutY257T可应用于医药、保健品等行业。

【技术实现步骤摘要】
一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体
本专利技术属于基因工程
，涉及一种木糖苷酶突变体MutY257T及其应用，具体为一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体。
技术介绍
木聚糖广泛存在于植物和藻类中，其主链主要由木糖分别经β-1,4糖苷键和β-1,3糖苷键聚合而成。木糖苷酶属于木聚糖降解酶，其能水解内切木聚糖酶作用于木聚糖后的产物——木寡糖，形成木糖，已报导的大部分木糖苷酶是β-1,4键糖苷水解酶(PhuengmaungPetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2018,112:72–78.)。除了木聚糖外，一些天然成分也含有木糖。三七皂苷R1和R2含有木糖基团，该木糖基团与相邻的葡萄糖基团以β-1,2糖苷键进行连接(图1)，而不是与其它木糖基团经β-1,4糖苷键相连接。基于以上原因，再加上底物昂贵造成筛选不便等原因，已发现的能去除三七皂苷R1和R2中木糖基团的木糖苷酶非常稀少。去除三七皂苷R1和R2中的木糖基团，可分别得到人参皂苷Rg1和Rh1。人参皂苷Rg1具有保护神经、保肝、抗氧化、抗衰老、防治老年痴呆等作用，在药品和保健品中具有应用价值(GaoYetal.JournalofEthnopharmacology,2017,206:178–183.)。由于三七皂苷R1和R2在结构上较相似，有些能水解三七皂苷R1的木糖苷酶也能水解三七皂苷R2(ShinKCetal.BiotechnologyLetters,2014,36:2275–2281.)，从而在制备人参皂苷Rg1时易形成副产物人参皂苷Rh1，不利于人参皂苷Rg1的纯化。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的旨在提供一种能选择性地将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体MutY257T，可应用于医药、保健品等行业。为了实现该技术目标，本专利技术具体通过以下技术方案实现：通过蛋白与底物的分子对接等生物信息学技术，本专利技术设计了木糖苷酶突变体MutY257T，所述的突变体MutY257T的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，与数据库记录的木糖苷酶序列JB13GH39(序列号MG838204翻译蛋白序列；SEQIDNO.3)相比，MutY257T在JB13GH39的第257位点发生了突变，即JB13GH39的第257位点是氨基酸“Y”，而在MutY257T序列中对应的氨基酸是第243位点“T”。用于编码所述的木糖苷酶突变体MutY257T的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因的重组载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因的重组菌。本专利技术所述的木糖苷酶突变体MutY257T的制备方法，具体包括以下步骤：1)扩增或基因合成野生酶JB13GH39无信号肽的编码序列，如SEQIDNO.4所示；2)将1)中序列与表达载体pEasy-E2进行连接，得到重组表达质粒pEasy-E2-jB13GH39；3)以重组质粒pEasy-E2-jB13GH39为模板，根据南京诺唯赞生物科技有限公司突变试剂盒MutIIFastMutagenesisKitV2方法进行突变和重组，突变引物为5'ACAGCaccGGCGTCGATGGCGGCTTTCTCGAC3'和5'ATCGACGCCggtGCTGTGCGTGGTGACGAAAT3'，得到含MutY257T编码基因的重组质粒pEasy-E2-MutY257T；4)用质粒pEasy-E2-MutY257T转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得包含MutY257T编码基因的重组菌株；5)培养重组菌株，诱导木糖苷酶突变体MutY257T表达；6)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体MutY257T。在本专利技术的另一方面，上述所述的突变体MutY257T在制备医药和保健品中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的有益效果为：与野生酶JB13GH39相比，突变酶MutY257T保持了降解三七皂苷R1的能力，但突变酶MutY257T几乎不能降解三七皂苷R2。附图说明图1：利用木糖苷酶将三七皂苷R1和R2分别转化为人参皂苷Rg1和Rh1的示意图；图2：在大肠杆菌中表达的野生酶JB13GH39及其突变体MutY257T的SDS-PAGE分析，其中，M：蛋白质Marker；W：纯化的野生酶JB13GH39；257：纯化的突变体MutY257T；图3：纯化的野生酶JB13GH39水解三七皂苷R1的HPLC分析；a：人参皂苷Rg1，b：三七皂苷R1，c：三七皂苷R1+JB13GH39；图4：纯化的野生酶JB13GH39水解三七皂苷R2的HPLC分析；a：人参皂苷Rh1，b：三七皂苷R2，c：三七皂苷R2+JB13GH39；图5：纯化的突变体MutY257T水解三七皂苷R1的HPLC分析；a：人参皂苷Rg1，b：三七皂苷R1，c：三七皂苷R1+MutY257T；图6：纯化的突变体MutY257T水解三七皂苷R2的HPLC分析；a：人参皂苷Rh1，b：三七皂苷R2，c：三七皂苷R2+MutY257T。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术以下实施例中的实验材料和试剂：菌株及载体：鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC1.10968，由云南师范大学提供；大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。酶类及其它生化试剂：Nickel-NTAAgarose购自QIAGEN公司，DNA聚合酶、dNTP及II试剂盒购自南京诺维赞公司，三七皂苷R1和R2及人参皂苷Rg1和Rh1购自上海源叶生物科技有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1野生酶JB13GH39表达载体的构建和转化1)提取鞘氨醇单胞菌基因组DNA将培养2d的液体菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mMTris，20mMEDTA，NaCl500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体为MutY257T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，其特征在于，所述的突变体为MutY257T，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种能将三七皂苷R1转化为人参皂苷Rg1的木糖苷酶突变体，其特征在于，突变体MutY257T在JB13GH39的第257位点发生了突变，即JB13GH39的第257位点是氨基酸“Y”，而在MutY257T序列中对应的氨基酸是第243位点“T”。3.权利要求1所述的木糖苷酶突变体的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组载体，其特征在于，包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因。5.一种重组菌，其特征在于，包含木糖苷酶突变体MutY257T编码基因。6.权利要求1所述的木糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕊，周峻沛，黄遵锡，李娜，岑潇龙，唐湘华，许波，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南,53