一种杂色曲霉HY12的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种杂色曲霉HY12的筛选方法，包括感病斜纹夜蛾幼虫的处理；感病斜纹夜蛾的菌株初筛选；进行虫体接种试验；筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株并进行分子生物学鉴定。本发明专利技术提供的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致畸率和致死率，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。

【技术实现步骤摘要】
一种杂色曲霉HY12的筛选方法
本专利技术涉及生物制药领域，特别是涉及一种杂色曲霉HY12的筛选方法。
技术介绍
自专利技术化学农药之后，化学农药以每年5％惊人速度增长。虽然在过去的几十年中，化学农药在农业增产和害虫防治中起到了重要作用，但化学农药的大量使用，带来了严重的“3R”问题(即抗药性Resistance，农药残留Residence，再猖獗Resurgence)，也带来了一系列的生态环境问题。长期大量使用化学农药导致抗药性害虫增加，特别是近10年来，棉铃虫、蚜虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、叶螨类等多发性害虫对菊酯类、有机磷类化学农药的抗药性增加了几百乃至数千倍。化学农药的施用，使农产品中农药残留量增加，严重污染了环境，危及人类建康及生命。随着人们生活水平的提高，人们对环境的要求越来越高，因此迫使人们寻找一种害虫防治替代方法。斜纹夜蛾(Spodopteralitura)属鳞翅目夜蛾科，危害寄主相当广泛，除十字花科蔬菜外，还可危害包括瓜、茄、豆、葱、韭菜、菠菜以及粮食、经济作物等近100科、300多种植物，是一种重要的农作物害虫，以幼虫咬食叶片、花蕾、花及果实，初龄幼虫啮食叶片下表皮及叶肉，仅留上表皮呈透明斑。斜纹夜蛾4龄以后进入暴食，咬食叶片，仅留主脉，在包心椰菜上，幼虫还可钻入叶球内危害，把内部吃空，并排泄粪便，造成污染，使之降低乃至失去商品价值。斜纹夜蛾虫害在国内各地都有发生，对生产带来了极大的损害。为了规避杀虫剂抗性的问题，也使农民和种植者能够回应消费者对农药残留问题，需要一个有效的方法来控制斜纹夜蛾而不涉及化学药品残留。现在研究阶段，均把研究方向转向了杀虫菌剂，但是对斜纹夜蛾强感病性菌株大多来源于土样自然分离，此种分离方法分离率低，且实验周期长，针对斜纹夜蛾的感病率也较低，且此方法并不可控。因此，提供一种实验室可控的，能够高效率快速稳定的分离强致病斜纹夜蛾的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种杂色曲霉HY12的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，本专利技术从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致死率和致畸率，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种杂色曲霉HY12(Aspergillusversicolor)的筛选方法，所述杂色曲霉HY12菌株于2017年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCCNO：14790；具体筛选步骤如下：(1)感病斜纹夜蛾幼虫的处理从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，用消毒灭菌后的挑针挑取虫体上的霉层，放于预先准备好的HECK培养基上，划线处理或将表面没有霉层的感病斜纹夜蛾幼虫浸入75％酒精2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释涂布培养；(2)感病斜纹夜蛾的菌株初筛选将步骤(1)所述匀浆利用无菌水按梯度稀释成10倍液、100倍液、1000倍液，并涂布在筛选培养基平板表面，并涂布在筛选培养基平板表面，25-28℃培养45-50h，挑取单菌落于SDAY真菌培养基平板上纯培养，获得13个真菌菌株并对真菌进行纯培养，经形态学观察初步鉴定，它们分别为白僵菌属(Beauverja)2株，镰刀菌属(Fusarium)2株，曲霉属(Aspergullus)3株，木霉属(Trichoderma)1株，青霉属(Penicillium)1株，枝孢属(Cladosporium)1株、未鉴定真菌3株。(3)进行虫体接种试验将步骤(2)所述若干菌株，在所述真菌培养基平板上培养至充分产孢，利用分生孢子配制相应的孢子悬浮液后，分别感染斜纹夜蛾3龄幼虫；(4)筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株并进行分子生物学鉴定进行毒力回归分析筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株，并进行分子生物学鉴定。其中，毒力回归分析方法为以虫生真菌对斜纹夜蛾的累积死亡率的概率值为因变量(y)，处理浓度对数为自变量(x)，用多重线性回归方法建立各菌株的毒力回归线性模型，再利用此模型求得致死中浓度(LT50)。本专利技术筛选出的杂色曲霉HY12对斜纹夜蛾致病性(感染性)强，从接种至斜纹夜蛾起，接种菌株HY12的试虫行动迟缓，且提前进入蛹期，化蛹期间试虫畸形率和死亡率最高。进一步的，步骤(1)所述消毒方法为将表面没有霉层的所述幼虫浸入75％的酒精2-5s。进一步的，所述筛选培养基为HECK培养基；所述HECK培养基包括下列重量份数的组分：葡萄糖4份、蛋白胨2份，高锰酸钾0.025份，放线菌酮0.5份，庆大霉素0.2份，氨苄青霉素0.048份，琼脂2份和水100份。本专利技术以HECK培养基为筛选培养基，本专利技术公开的筛选培养基经过改进，能够有效地抑制杂菌的生长而高效地获得杂色曲霉。进一步的，所述真菌培养基为SDAY培养基，其中所述SDAY培养基包括以下重量份数的组分，葡萄糖4份，蛋白胨1份，酵母浸出粉1份，琼脂2份，庆大霉素0.2份和水100份。进一步的，步骤(3)中所述孢子悬浮液的制备方法为：在无菌条件下，挑取所述分生孢子粉，加入0.05％Tween80溶液配制成孢子悬浮液，使之达到108个/mL。孢子悬浮液为108个/mL，能将孢子较好的分散，便于下一步的吸取和接种，如果孢子悬浮液的浓度过大，则浓影响计数的精确性；反之，浓度过小过则降低接种成功率。进一步的，步骤(3)中所述孢子悬浮液感染斜纹夜蛾3龄幼虫的方法为：将所述斜纹夜蛾3龄幼虫置于底部垫吸水纸的培养皿中，吸取所述孢子悬浮液滴在所述斜纹夜蛾3龄幼虫体壁周围；待所述斜纹夜蛾3龄幼虫体壁干时，添加干净红薯叶，然后盖上纱布，置于室温下培养，每隔6h添加新鲜红薯叶。本专利技术公开了利用孢子悬浮液感染斜纹夜蛾3龄幼虫，其中1-3龄斜纹夜蛾幼虫易受真菌侵染，且以2龄幼虫的侵染率为最高,侵染率随处理时间延长、接种浓度增加而增大，被侵染斜纹夜蛾幼虫死亡通常发生在处理后的下一个龄期，故本专利技术选择较大的3龄虫作为试虫，验证HY12的优越性。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种杂色曲霉HY12的筛选方法，具有如下技术优点：本专利技术提供了一种杂色曲霉HY12的筛选方法，克服了传统利用土样法自然分离致病菌株效率低、针对性低、不可控、不易重复的缺陷，本专利技术从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，从幼虫体内腐烂的内脏中分离致病菌株，所得到的杂色曲霉HY12的发酵物可感染斜纹夜蛾，使其提前进入蛹期，对化蛹期间的斜纹夜蛾具有较高的致死率和致畸率，对斜纹夜蛾的繁衍具有较好的抑制作用，为后期安全有效地防治斜纹夜蛾奠定基础，为新杀虫菌剂的创制提供新颖的模板。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂色曲霉HY12的筛选方法，其特征在于，所述杂色曲霉HY12菌株于2017年10月30保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14790；具体筛选步骤如下：(1)感病斜纹夜蛾幼虫的处理从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，用消毒灭菌后的挑针挑取虫体上的霉层，放于预先准备好的HECK选择培养基上，划线处理或将表面没有霉层的感病斜纹夜蛾幼虫浸入75％酒精2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释涂布培养；(2)感病斜纹夜蛾的菌株初筛选将步骤(1)所述匀浆利用无菌水按梯度稀释成10倍液、100倍液、1000倍液，并涂布在HECK筛选培养基平板表面，25‑28℃培养45‑50h，挑取单菌落于SDAY培养基上纯培养，获得若干菌株；(3)进行虫体接种试验将步骤(2)所述若干菌株，在所述真菌培养基平板上培养至充分产孢，利用分生孢子配制相应的孢子悬浮液后，分别感染斜纹夜蛾3龄幼虫；(4)筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株并进行分子生物学鉴定进行毒力回归分析筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株，并进行分子生物学鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种杂色曲霉HY12的筛选方法，其特征在于，所述杂色曲霉HY12菌株于2017年10月30保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO：14790；具体筛选步骤如下：(1)感病斜纹夜蛾幼虫的处理从斜纹夜蛾为害区采集自然死亡的感病斜纹夜蛾的幼虫，用消毒灭菌后的挑针挑取虫体上的霉层，放于预先准备好的HECK选择培养基上，划线处理或将表面没有霉层的感病斜纹夜蛾幼虫浸入75％酒精2s，消毒体表后，无菌条件下将其已腐烂的内脏制成匀浆，用无菌水稀释涂布培养；(2)感病斜纹夜蛾的菌株初筛选将步骤(1)所述匀浆利用无菌水按梯度稀释成10倍液、100倍液、1000倍液，并涂布在HECK筛选培养基平板表面，25-28℃培养45-50h，挑取单菌落于SDAY培养基上纯培养，获得若干菌株；(3)进行虫体接种试验将步骤(2)所述若干菌株，在所述真菌培养基平板上培养至充分产孢，利用分生孢子配制相应的孢子悬浮液后，分别感染斜纹夜蛾3龄幼虫；(4)筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株并进行分子生物学鉴定进行毒力回归分析筛选出对斜纹夜蛾强致病性菌株，并进行分子生物学鉴定。2.根据权利要求1所述的一种杂色曲霉HY12的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述消毒方法为将表面没...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭琳，胡秋龙，刘双清，柏连阳，汤心砚，程予奇，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43