利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种利用pAd‑Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，该方法首先通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS区全长序列并构建到pAdTrack‑CMV载体上，得到pAdTrack‑Mef2a基因克隆载体，然后与腺病毒骨架载体pAd‑Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd‑Mef2a，最后将病毒重组子pAd‑Mef2a转染到293A细胞中，经包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒。该牛MEF2A基因过表达腺病毒可以实现牛MEF2A基因在细胞中的高丰度表达，为今后在细胞水平上研究MEF2A的功能及其作用机制提供基础。

【技术实现步骤摘要】
利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法
本专利技术属于分子生物学、细胞工程
，具体涉及一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法。
技术介绍
牛肌肉的大小、生长速度、理化特性在一定程度上直接影响着牛肉的产量和品质。哺乳动物肌肉的生长发育主要包括胚胎时期肌细胞的增殖和出生后肌细胞的结构增大和肌纤维的再生，这些过程受细胞外多种因子的信号刺激以及由此引发的细胞内信号的级联反应，这些信号转导反应最终汇集于肌生成调节因子(MyogenicRegulatoryFactors，MRFs)家族的表达调控，在肌肉发生过程中肌细胞增强因子2A(MyocyteEnhancerFactor2A，MEF2A)与MRFs及其他功能蛋白质相互作用，协同促进肌细胞增殖和分化过程。目前用于实现基因表达的方法主要有基因编辑介导的基因敲入技术、质粒载体介导的基因表达、逆转录病毒载体介导的基因表达和西安并组载体介导的基因表达。真核表达载体具有细胞毒性小、安全性高等优点，但由于质粒载体很难转染大多数原代细胞细胞，并且携带的外源基因在细胞表达时间很短，难以达到实验要求。逆转录病毒具有包装速度快、表达效率高，并能够制备特定序列表达的细胞株等优点，但因其安全性较低，且只侵染处于增殖期的细胞，其应用范围也受到限制。与质粒载体、逆转录病毒载体不同，腺病毒表达载体具有安全性高、表达效率高、携带外源基因序列长、表达实效长，且能侵染处于增殖期和静息期的细胞，是一种理想的实验材料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，为今后在细胞水平上研究MEF2A的功能及其作用机制提供基础。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，在NCBI数据库中查询牛MEF2A基因序列，设计包含酶切位点在内的引物，通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS全长序列；步骤二，将牛MFE2A基因连接到pMD-19T-Simple载体上，通过转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性细胞克隆进行质粒提取、测序，得到pMD-19T-MEF2A基因克隆载体；步骤三，将牛MEF2A基因构建到pAdTrack-CMV载体上，得到pAdTrack-Mef2a，然后与腺病毒骨架载体pAd-Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd-Mef2a；步骤四，将病毒重组子pAd-Mef2a转染到293A细胞中，进行腺病毒的包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒(命名为OE-2A)。根据本专利技术，所述的引物序列如下：上游引物(Forwardprimer)：5-CGGGGTACCGCCACCATGGGGCGGAAGAAAATACAAATC-3；下游引物(Reverseprimer)：5-CCCAAGCTTTTAGGTCACCCACGCATCCATC-3；其中，黑色下划线标记表示酶切位点的保护碱基，上游引物黑色加粗部分的标记表示KpnⅠ酶切位点，上游引物黑色下划线标记表示Kozak序列，下游引物黑色加粗部分的标记表示HindⅢ酶切位点。本专利技术的利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，具有以下优点：(1)对构建的牛MEF2A基因过表达腺病毒利用LaSRT法在293A细胞中进行病毒的检测，结果表明，所构建的牛MEF2A基因过表达腺病毒具有高达109U/ml的滴度。(2)该pAd-Easy1腺病毒载体系统表达有绿色荧光蛋白(GFP)，在实验实施过程中，可将GFP作为表达效率的指标，以GFP的荧光亮度间接反映MEF2A腺病毒表达载体的表达效率。(3)pAd-Easy1腺病毒载体系统能够介导牛MEF2A基因的高效表达。在肌细胞70％密度时侵染OE-2A病毒，72h后提取细胞总RNA，并运用qRT-PCR技术对牛MEF2A基因的mRNA的表达进行检测，结果发现，随着OE-2A病毒添加量的逐渐加大，牛MEF2A基因可以实现越来越高效的表达，相对于GAPDH的表达量可达600倍。(4)所构建的牛MEF2A基因过表达腺病毒，显著提高了牛MEF2A基因的外源表达效率，为今后在细胞水平上研究MEF2A的功能及其作用机制提供基础。附图说明图1是本专利技术的利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的示意图；图2是牛MEF2A基因的CDS区全长扩增电泳图；图3是pAdTrack-Mef2a酶切鉴定图；图4是pAd-Mef2a酶切鉴定图；图5是牛MEF2A基因过表达腺病毒包装、扩繁图谱；图6是牛MEF2A基因过表达腺病毒滴度测定图；图7是牛MEF2A基因过表达腺病毒过表达效率鉴定图；下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的详细说明。具体实施方式本实施例给出一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，按下列步骤进行：步骤一，在NCBI数据库中查询牛MEF2A基因序列，设计包含酶切位点在内的引物，通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS全长序列；步骤二，将牛MFE2A基因连接到pMD-19T-Simple载体上，通过转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性细胞克隆进行质粒提取、测序，得到pMD-19T-MEF2A基因克隆载体；步骤三，将牛MEF2A基因构建到pAdTrack-CMV载体上，得到pAdTrack-Mef2a，然后与腺病毒骨架载体pAd-Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd-Mef2a；步骤四，将病毒重组子pAd-Mef2a转染到293A细胞中，进行腺病毒的包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒。以下实施例涉及的载体、菌株、细胞、试剂来源如下：(1)pAdEasy-1腺病毒表达载体系统为国家肉牛改良中心保存。(2)引物由上海生工生物工程有限公司合成。(3)pMD-19T-Simple载体、内切酶、连接酶、实时荧光定量PCR试剂盒均购自Takara公司。(4)KOD-PLUS高保真PCR酶，购自东洋纺公司。(5)DH5α，购自天根生化科技有限公司。(6)质粒提取、胶回收试剂盒，购自OMEGA公司。(7)骨骼肌成肌细胞，为国家肉牛改良中心秦川牛后腿肌肉通过酶消化法分离获得。(8)胎牛血清购自Invitrogen公司，DMEM培养基、双抗购自Hyclone公司，转染试剂购自Roche公司。实施例1：牛MEF2A基因CDS序列克隆本实验采用pAdEasy-1腺病毒表达载体系统，以GenBank公布的牛Mef2a基因序列(AccessionNumber：NM_001083638)为模板，设计并合成引物，扩增牛Mef2a基因CDS全长序列。所述的引物序列如下：上游引物(Forwardprimer)：5-CGGGGTACCGCCACCATGGGGCGGAAGAAAATACAAATC-3；下游引物(Reverseprimer)：5-CCCAAGCTTTTAGGTCACCCACGCATCCATC-3；其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用pAd‑Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，在NCBI数据库中查询牛MEF2A基因序列，设计包含酶切位点在内的引物，通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS全长序列；步骤二，将牛MFE2A基因连接到pMD‑19T‑Simple载体上，通过转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性细胞克隆进行质粒提取、测序，得到pMD‑19T‑MEF2A基因克隆载体；步骤三，将牛MEF2A基因构建到pAdTrack‑CMV载体上，得到pAdTrack‑Mef2a，然后与腺病毒骨架载体pAd‑Easy1在BJ5183感受态细胞中同源重组，组建病毒重组子pAd‑Mef2a；步骤四，将病毒重组子pAd‑Mef2a转染到293A细胞中，进行腺病毒的包装、扩繁、鉴定，得到高滴度的牛MEF2A基因过表达腺病毒。

【技术特征摘要】
1.一种利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，在NCBI数据库中查询牛MEF2A基因序列，设计包含酶切位点在内的引物，通过PCR技术克隆牛MEF2A基因CDS全长序列；步骤二，将牛MFE2A基因连接到pMD-19T-Simple载体上，通过转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并挑选阳性细胞克隆进行质粒提取、测序，得到pMD-19T-MEF2A基因克隆载体；步骤三，将牛MEF2A基因构建到pAdTrack-CMV载体上，得到pAdTrack-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亚宁，昝林森，杨武才，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61