一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法技术

本发明专利技术提供了一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。该方法首先体外将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，再刺激中心粒细胞产生微囊泡。本发明专利技术制备中性粒细胞微囊泡的方法突破了体内提取中性粒细胞的局限，为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，且制备方法简单易行，为进一步中性粒微囊泡的研究奠定了基础；本发明专利技术获得的中性粒微囊泡可进行后续的WB，流式细胞分析，动物实验等科学研究，为进一步研究中性粒细胞微囊泡的功能提供了便利，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法
本专利技术属于生物
更具体地，涉及一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。
技术介绍
中性粒细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分，也是最先到炎症区域发挥免疫防御作用的效应细胞之一。成熟血液中的中性粒细胞在体外寿命短，而且无法进行转染，这些特性使得对中性粒细胞功能机制的研究进程非常缓慢，因此，建立一种体外中性粒细胞模型，可以为中性粒细胞功能的分子机制研究奠定基础。另外，微囊泡是指来源于原核和真核生物的细胞膜的微囊泡，含有核酸、蛋白质及小的代谢分子。微囊泡通过和靶点的细胞的相互作用发挥重要的生理和病理功能。微囊泡可做为疾病的生物标志物，中性粒细胞的微囊泡具备抗菌的作用。因此，开发一种高效简易的制备中性粒细胞微囊泡的方法，将对中性粒微囊泡的功能研究发挥重要的作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。该方法首先体外将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，之后刺激中心粒细胞产生微囊泡，制备的中性粒微囊泡可进行后续的WB、流式细胞分析、动物实验等科学研究，而且该方法为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，制备方法简单易行，应用前景好。本专利技术的目的是提供一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法。本专利技术另一目的是提供由上述方法制备得到的中性粒细胞微囊泡。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，该方法首先将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，之后刺激中心粒细胞产生微囊泡，并对微囊泡进行浓缩及离心收集。优选地，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞所使用的诱导剂为二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜(DMSO)或视黄酸(RA)。优选地，刺激中心粒细胞产生微囊泡所使用的试剂为丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）。优选地，所述人类白血病细胞为人类白血病细胞HL-60。更优选地，所述体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：S1.体外诱导制备中性粒细胞：利用二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞；S2.制备微囊泡：利用丙二醇甲醚醋酸酯刺激中心粒细胞产生微囊泡；S3.微囊泡的分离：对微囊泡进行浓缩收集。其中，优选地，步骤S1中所述二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸的浓度为0.4%～0.6%。更优选地，步骤S1中所述二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸的浓度为0.5%。优选地，步骤S1中人类白血病细胞在诱导之前先培养至对数生长期。优选地，步骤S1中所述诱导时人类白血病细胞的初始细胞浓度为2×104cells/mL～2×106cells/mL。更优选地，步骤S1中所述诱导时人类白血病细胞的初始细胞浓度为2×105cells/mL。优选地，步骤S2中所述丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为8nM～12nM。更优选地，步骤S2中所述丙二醇甲醚醋酸酯的浓度为10nM。优选地，步骤S2中刺激之前中心粒细胞的浓度为106cells/ml～108cells/ml。更优选地，步骤S2中刺激之前中心粒细胞的浓度为107cells/ml。优选地，步骤S3所述浓缩收集的方法为差速离心法。具体是将经过刺激中心粒细胞产生微囊泡的细胞液体经过离心得到富含微囊泡的上清，再将上清离心过滤浓缩，浓缩后富含微囊泡的溶液再离心去除上清，沉淀即微囊泡。其中第一步离心的条件为3000g～5000g，在0℃～10℃离心10～20min（优选4000g在4℃离心15min），过滤浓缩的方法为通过Centriprep离心过滤管（10kDaMW，Millipore）进行浓缩，第二步再离心的条件为150000g～180000g在0℃～10℃离心30～50min（优选160000g在4℃离心40min）。更进一步优选地，所述体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以下步骤：（1）细胞准备：人类白血病细胞HL-60扩大培养至对数生长期；（2）细胞诱导：利用浓度为0.4%～0.6%（优选0.5%）的二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸对对数生长期的细胞以起始2×104cells/mL～2×106cells/mL（优选2×105cells/mL）的浓度进行诱导，形成中性粒细胞；（3）细胞诱导率的验证：诱导后的细胞在第六天，验证细胞诱导率（如用瑞氏染色法和流式细胞分析方法验证），进行下一步操作（优选地当诱导率大于80%时进行下一步操作）；（4）刺激细胞产生微囊泡：利用浓度为8nM～12nM（优选10nM）的丙二醇甲醚醋酸酯刺激细胞浓度为106cells/ml～108cells/ml（优选107cells/mL）的中心粒细胞产生微囊泡；（5）对微囊泡进行浓缩收集：步骤（4）的产物经过离心得到富含微囊泡的上清，再将上清离心过滤浓缩，浓缩后富含微囊泡的溶液再离心去除上清，沉淀即微囊泡。用0.9%氯化钠重悬，-80℃保存备用。其中，优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的培养基为RPMI-1640培养基。更优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的培养基中需加入25mMHEPESGlutaMAX、10%FBS、100units/ml的盘尼西林、100ug/ml的链霉素、1%的丙酮酸盐。更优选地，步骤（1）中培养人类白血病细胞的条件为37℃含有5%CO2的培养环境内扩大培养，细胞2～3天换液一次。优选地，步骤（4）中使用RPMI1640、25mMHEPESGlutaMAX对中心粒细胞（诱导后的HL-60细胞）的浓度进行调整。优选地，步骤（5）中的第一步离心的条件为3000g～5000g在0℃～10℃离心10～20min。更优选地，步骤（5）中的第一步离心的条件为4000g在4℃离心15min。优选地，步骤（5）中过滤浓缩的方法为通过Centriprep离心过滤管（10kDaMW，Millipore）进行浓缩。优选地，步骤（5）中的第二步再离心的条件为150000g～180000g在0℃～10℃离心30～50min。更优选地，步骤（5）中的第二步再离心的条件为160000g在4℃离心40min。优选地，上述方法制备得到的中性粒细胞微囊泡也在本专利技术保护范围之内。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术记载的制备中性粒细胞微囊泡的方法突破了体内提取中性粒细胞的局限，为体外细胞制备，不涉及动物实验，保护了动物的生命，且制备方法简单易行，为进一步中性粒微囊泡的研究奠定了基础。本专利技术获得的中性粒细胞微囊泡可进行后续的WB，流式细胞分析，动物实验等科学研究，为进一步研究中性粒细胞的微囊泡的功能提供了便利，应用前景好。附图说明图1为细胞的瑞氏染色图，其中A为HL-60未诱导的细胞瑞氏染色图，B为HL-60细胞诱导后的瑞氏染色图。图2为流式细胞分析图，其中A为HL-60未诱导的细胞的流式细胞分析图，B为HL-60诱导后的细胞的流式细胞分析图。图3为HL-60未诱导和HL-60细胞诱导后的中性粒得率柱状图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1体外制备中性粒细胞微囊泡1、一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，包括以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，刺激中心粒细胞产生微囊泡。

【技术特征摘要】
1.一种体外制备中性粒细胞微囊泡的方法，其特征在于，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞，刺激中心粒细胞产生微囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞所使用的诱导剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，刺激中心粒细胞产生微囊泡所使用的试剂为丙二醇甲醚醋酸酯。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人类白血病细胞为人类白血病细胞HL-60。5.根据权利要求1～4任一所述方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.体外诱导制备中性粒细胞：利用二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或视黄酸将人类白血病细胞诱导为中性粒细胞；S2.制备微囊泡：利用丙二醇甲醚...

【专利技术属性】
技术研发人员：李燕，孙红宾，刘玉珍，焦路阳，莫清江，王嘉榕，
申请(专利权)人：新乡医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41