多肽、其生产方法和用途技术

本发明专利技术涉及多肽、其生产方法和用途。所述多肽包含N端区域和C端区域，其中所述N端区域包含SEQ ID No.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；其中所述C端区域包含以SEQ ID No.14所示的序列GPPGPCCGGG或者包含以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。本发明专利技术的多肽黏附效果明显优于商品化的人胶原蛋白的黏附效果。本发明专利技术的多肽具有抗HPV的性质。本发明专利技术为进一步优化治疗宫颈癌等HPV感染疾病提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
多肽、其生产方法和用途本申请要求2018年7月6日提交的、专利技术名称为“多肽、其生产方法和用途”的申请号201810736734.4的中国专利技术专利申请的优先权。
本专利技术属于基因工程
，涉及多肽、其生产方法和用途。
技术介绍
宫颈癌和乳头瘤病毒宫颈癌在全球女性癌症发病率中排名第四，一直是国际医学领域的关注热点。该癌症被确认由人乳头瘤病毒(HPV)所引发，HPV具有200多种亚型，又可根据其致癌性可分为“低危”型和“高危”型，低危型流行度高的代表类型为HPV6、HPV11等，主要引起良性的生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死。高危型包括HPV16、HPV18、HPV52、HPV58等，可引发宫颈癌。据WHO数据显示，2012年该疾病导致27万人的死亡。其中85％以上发生在低收入和中等收入国家。宫颈癌是生活在欠发达地区的妇女第二常患癌症，估计2012年有44.5万个新发病例，占全球新发病例的84％。随着我国性开放程度的加深，宫颈癌的发病率及发病年龄可能将有明显上升及提前的趋势。宫颈癌的发生发展与病毒持续性感染有关，目前对其的治疗主要是通过手术切除病灶，常用的治疗方法包括：循环电切手术(LEEP)、冷刀锥形切除术、电击疗法、冷凝和冷冻治疗法等。但由于HPV感染的特性，手术等方法无法起到预防病毒感染的作用，并且也不能完全清除病毒，复发率较高。目前针对人乳头瘤病毒上市了三种疫苗，这三种疫苗虽然能有效预防流行较广的HPV型的感染，并且能预防宫颈癌。但仍存在一定的局限性：例如(1)疫苗的接种范围有限。我国9价疫苗刚获批准，且一些年龄范围外的人群不适用；(2)型别局限性：已上市的这三种疫苗最多防止9种亚型人乳头瘤病毒的感染，但对其他HPV型别的感染无预防作用。从病毒生态学的角度，当主要的9种型别HPV被抑制后，其他型别的HPV可能成为主要流行株；(3)成本高、售价贵，限制了疫苗在发展中国家的推广；(4)当前疫苗均为预防性疫苗，对已感染人乳头瘤病毒的患者尚无临床数据支持具有治疗效果。因此，目前急需研发能够有效预防和控制HPV病毒感染的产品。受限于病毒学的发展以及人乳头瘤病毒的特性，目前世界上缺乏人乳头瘤病毒的活病毒系统来评价产品，且缺乏理想公认的动物模型，对于这种情况目前研究HPV产品公认的体外模型为HPV假病毒模型，该模型由HPVL1，L2蛋白和报告基因组成，是目前国内外学术界广泛使用来检测抗人乳头瘤病毒药物活性的体外模型。依靠此模型可以直观的评价产品活性。本专利技术提供了一种显著具有抗HPV活性的蛋白，为进一步优化治疗宫颈癌等HPV感染疾病提供了新的方法。胶原蛋白胶原蛋白一般为白色、透明、无分支的原纤维，是皮肤和骨骼的基础支撑物，可以占到蛋白质总量的25％～35％，主要分布于人体的皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等处，是这些组织的主要基质和支架，保护并连结各种组织，在体内发挥着重要的生理功能。因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中。以胶原蛋白的氨基酸组成而言：哺乳动物猪、牛与人的相似度为95％，鱼与人的相似度65％。虽然哺乳动物猪、牛等与人的胶原蛋白相似度较高，其仍然难以避免病毒感染以及致敏性的危险。而食用鱼类所萃取的胶原蛋白人体的利用率低于65％，无法完全被人体吸收与利用。所以其常用于食品运用，少部分运用于化妆品，但无法被用于医疗器械或较精密的组织工程产品。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。从结构上来说，人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂，所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。胶原蛋白最普遍的结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构，即由3条A肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质，这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个A肽链在分子结构上都是由重复出现的Gly-X-Y(X、Y代表Gly之外的任何氨基酸残基，X往往是Pro，Y往往是Hyp)肽段构成左手螺旋，3条链在氨基酸残基的相互作用下，以同一轴为中心，以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。在生物体中，胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始，经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化，受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外，还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部，胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋，从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此，按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性，无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。大多数经过制备后的胶原蛋白产品，拉伸强度较弱；纯胶原蛋白在体内降解较快，以及可能存在潜在的抗原性等，同时由于胶原蛋白的来源、加工工艺和原料配比的差异，产品的营养成分及饲用价值也不相同，且皮料在加工过程中不仅要接触许多化学物质，且易受到细菌的感染，严重限制了胶原蛋白的应用。虽然国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠，得到了含有人胶原蛋白的乳汁，但是这样生产的成本过高，生产周期过长，无法投入大规模生产。
技术实现思路
本专利技术部分基于以下发现：1.本专利技术的多肽C2R1T、C2R4T、C2R5T和C2R10T与现有人胶原蛋白相比具有相当或更高的细胞粘附效果；和2.本专利技术的治疗人乳头瘤病毒感染的蛋白C2R1T通过实验研究，可在HPV假病毒感染模型上，有效抑制HPV16，HPV18和HPV58高危型人乳头瘤病毒的感染。本专利技术经过实验数据揭示该抗病毒蛋白的作用机制是：C2R1T蛋白特异地与HPVL1蛋白结合，从而抑制病毒感染细胞。通过机制研究发现蛋白作用在病毒感染的早期阶段—病毒入侵阶段，并且不具有灭活效应。3.实验证明C2R1T蛋白主要依靠核心序列R1P4GEPGLQGPAGPPGEKGEPGDDGPSGAEGPP(SEQIDNO:18)起到结合病毒蛋白作用，与其他同样来自C2R1T的多肽相比较R1P4具有抗病毒活性，其他序列不具有良好的抗病毒活性。本专利技术的目的之一在于提供可抑制人乳头瘤病毒感染的活性蛋白，通过对病毒的抑制从而改变疾病进程。主要思路在于通过抑制HPV入侵靶细胞，从而阻断病毒持续性感染，最终降低病毒量，及预防/治疗其所引发的宫颈癌等疾病。针对上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了：1.多肽，所述多肽包含N端区域和C端区域，其中所述N端区域包含SEQIDNo.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；其中所述C端区域包含以SEQIDNo.14所示的序列GPPGPCCGGG；其中优选地，所述多肽是胶原蛋白多肽，优选是人源胶原蛋白多肽；其中优选地，所述N端区域包含N端序列的n个重复，n为大于等于1的整数，优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中优选地，当n为大于等于2的整数时，各个N端序列是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基；其中优选地，所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基，条件是所述多肽具有细胞粘附活性；或者所述多肽包含(1)以SEQIDNO:18所示的氨基酸序列；(2)S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多肽，所述多肽包含N端区域和C端区域，其中所述N端区域包含SEQ ID No.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；其中所述C端区域包含以SEQ ID No.14所示的序列GPPGPCCGGG；其中优选地，所述多肽是胶原蛋白多肽，优选是人源胶原蛋白多肽；其中优选地，所述N端区域包含N端序列的n个重复，n为大于等于1的整数，优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中优选地，当n为大于等于2的整数时，各个N端序列是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基；其中优选地，所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基，条件是所述多肽具有细胞粘附活性；或者所述多肽包含(1)以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列；或者(3)与以SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的序列，条件是多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16、18和/或58型活性。...

【技术特征摘要】
2018.07.06 CN 20181073673441.多肽，所述多肽包含N端区域和C端区域，其中所述N端区域包含SEQIDNo.13中的至少48个连续的氨基酸残基的N端序列；其中所述C端区域包含以SEQIDNo.14所示的序列GPPGPCCGGG；其中优选地，所述多肽是胶原蛋白多肽，优选是人源胶原蛋白多肽；其中优选地，所述N端区域包含N端序列的n个重复，n为大于等于1的整数，优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；其中优选地，当n为大于等于2的整数时，各个N端序列是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基；其中优选地，所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基，条件是所述多肽具有细胞粘附活性；或者所述多肽包含(1)以SEQIDNO:18所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO:18所示的氨基酸序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列；或者(3)与以SEQIDNO:18所示的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的序列，条件是多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16、18和/或58型活性。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述N端序列包含选自下组的序列：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4或这些中的任一种序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的序列。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其包含(1)SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、或SEQIDNo.11的氨基酸序列；(2)SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、或SEQIDNo.11的氨基酸序列中取代、添加、删除或缺失了1或多个，例如2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列；或者(3)与SEQIDNo.5、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9、或SEQIDNo.11的氨基酸序列具有83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％或97％序列同一性的序列，条件是所述多肽具有细胞粘附活性或者所述多肽保留抗HPV活性，优选抗HPV16、18和/或58型活性。4.多核苷酸，其编码根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中所述多核苷酸优选是SEQIDNo.6、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10、或SEQIDNo.12。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨霞，陆路，姜世勃，花晨，刘泽众，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：山西,14