一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法技术

本发明专利技术公开一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，属于生物技术领域的免疫学检测方法；本发明专利技术以抗原亲和纯化的催乳素抗体为捕获抗体，生物素标记的催乳素抗体为检测抗体，鹅催乳素重组蛋白为标准品，建立了一种检测鹅催乳素的双抗体夹心ELISA方法；该方法易于操作，灵敏度高，重复性好，能够准确检测鹅血浆中催乳素浓度的变化，弥补了国内外水禽催乳素检测方法的不足。

【技术实现步骤摘要】
一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法
本专利技术属于生物
的免疫学检测方法，具体涉及一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法。
技术介绍
催乳素(Prolactin,PRL)是一种主要由动物垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质激素。在哺乳动物中，PRL的主要作用是促进乳腺发育，刺激并维持泌乳。在禽类中，PRL的主要作用是促进和维持就巢，以及感受光周期调节禽类的季节性繁殖。PRL的定量检测方法包括生物学测定方法和免疫学测定方法。生物学测定方法包括鸽嗉囊促进实验、兔泌乳促进实验和Nb2型淋巴细胞增殖实验等。虽然生物学测定方法能够检测具有生物学活性的PRL含量，但是其检测限高、重复性差、耗时长。免疫测定方法则利用了抗原-抗体反应，其特异性强，灵敏度高。其中，放射免疫法(RIA)的灵敏度比酶联免疫法(ELISA)高，但其缺点也十分明显，如同位素标记有效期短、损害实验人员健康和危害环境等。化学发光和电化学发光法的灵敏度优于RIA法和ELISA法，但其需要的仪器昂贵，且都为针对人PRL开发的封闭系统，限制了它的广泛使用。因此，ELISA法因其灵敏度高，简单快速，重复性较好，避免了RIA法的缺点，受到众多实验室的欢迎。目前，国内外许多厂商开发了分别适用于人类以及鼠、猪、羊、牛和鸡等动物的PRLELISA试剂盒，但是缺乏适用于水禽如鸭和鹅的PRLELISA试剂盒。虽然鸡和鸭、鹅PRL蛋白之间的氨基酸序列同源性较高，但是将鸡PRLELISA试剂盒应用于水禽PRL的定量检测，目前尚无文献报道。目前市场上销售的一些鸭和鹅PRLELISA检测试剂盒，其检测灵敏度无法验证，且不能实现鹅PRL的定量检测。此外，这些商品化试剂盒中所使用的PRL标准品大多是从动物垂体中提取的天然PRL蛋白，其提取纯化的工艺步骤复杂、难度大、产量低，使得目前的试剂盒售价均高昂。成熟的人PRL蛋白是由199个氨基酸残基组成的多肽，分子量为23kD。但是，正常人的血清中存在着多种形式的PRL异构体，分子量主要为16，22，23，48和56kD。这些不同分子量的PRL异构体是由PRL转录产物的可变剪接，翻译后修饰(如糖基化和磷酸化)以及多聚体化等原因造成的，其对于PRL生理功能的发挥具有重要作用。已有文献报道，以兔抗鸡PRL多克隆抗体为检测抗体，在鸡和鹅垂体提取物中均发现了从20-45kD范围内5种不同分子量的PRL异构体，这表明在鸡和鹅体内也存在着多种PRL异构体。因此，在开发禽类PRL的ELISA检测方法时，抗PRL抗体是否能够特异性识别多种PRL异构体是至关重要的。目前，文献报道的兔抗鸡PRL多克隆抗体是采用鸡垂体提取的天然PRL蛋白作为抗原获得的。由于动物体内天然蛋白的提取困难，通常采用基因工程技术生产的重组蛋白作为替代品来获得抗PRL抗体。目前，基因工程技术多采用原核蛋白表达系统生产重组蛋白，该重组蛋白不存在翻译后修饰，与天然蛋白相似度较低。随着对水禽卵泡发育和产蛋调控技术等研究的深入，迫切需要开发一种适用于测定水禽PRL的ELISA检测方法。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术利用基因工程技术制备鹅PRL重组蛋白，并通过制备相应的高特异性抗体，建立了一种具有灵敏度高、特异性强、准确、方便操作的鹅PRL双抗体夹心ELISA检测方法，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测；所述鹅PRL重组蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步，所述鹅PRL多克隆抗体是通过如下方法制备的：首先利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清，然后对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和纯化后，获得鹅PRL多克隆抗体；其中，所述利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔具体步骤如下：选取2只2月龄雌性新西兰大白兔，将鹅PRL重组蛋白与弗氏佐剂等量混合后进行首次免疫和加强免疫，每次颈背部皮下多点注射抗原0.5mg，每隔3周加强免疫1次；第2次加强免疫后，选择抗血清ELISA效价大于50K的新西兰大白兔，进行颈动脉取血；将获得的血样在37℃生化箱中倾斜放置2h，使其完全凝固，再转至4℃过夜，使血凝块进一步收缩，第二天将析出的血清吸出，即获得了含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清；所述对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和纯化，具体步骤如下：1)将鹅PRL重组蛋白偶联到溶胀后的CNBr-activatedSepharoseTM4B上，制备抗原亲和层析柱；2)用0.2MNaHCO3pH9.0缓冲液以0.5mL/min流速平衡亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；3)抗血清经0.45μm滤膜过滤后以0.5mL/min流穿亲和层析柱；4)用10mMPBSpH7.4缓冲液以1mL/min流速洗涤亲和层析柱，至流出液OD280值到达基线；5)用100mM甘氨酸pH2.8缓冲液以1mL/min流速洗脱亲和层析柱，收集流出液，并立即用1MNaHCO3pH9.0缓冲液中和至中性；6)上述收集的抗体溶液加入透析袋中，置于10mMPBSpH7.4缓冲液中透析过夜，获得鹅PRL多克隆抗体。进一步，所述生物素标记PRL抗体是通过如下方法获得的：将鹅PRL多克隆抗体用100mM碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/mL，获得抗体溶液；每1mL抗体溶液中加入120μlN-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，室温、避光条件下持续搅拌90min，然后加入4.8μl1MNH4Cl溶液终止反应；将反应液置于10mMPBS缓冲液中透析，以去除游离的N-羟基琥珀酰亚胺生物素，获得生物素标记PRL抗体。进一步，本专利技术所述以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测的具体步骤为：1)用PBS缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至5μg/mL，加入酶标板中，4℃孵育过夜；次日弃去液体，加入含有质量百分数为5％牛血清白蛋白的PBST溶液，37℃孵育1h；再次弃去液体，PBST溶液洗板，备用；2)标准品检测：用PBST将鹅PRL重组蛋白依次稀释至浓度为0、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5ng/mL，加入步骤1)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板；3)待测样本检测：用PBST溶液将待测样本稀释至标准品浓度范围内，加入步骤1)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h，弃去反应液，PBST溶液洗板；4)用PBST溶液将生物素标记PRL抗体稀释至0.14μg/mL，分别加入步骤2)和步骤3)获得的酶标板中，37℃孵育1h后，PBST溶液洗板；5)用PBST溶液将链霉亲和素-过氧化物酶结合物按照体积比1:12000稀释后，加入步骤4)获得的酶标板中，37℃孵育0.5h；弃去反应液，PBST溶液洗板；6)加入TMB显色液，37℃孵育10min后，加入1M盐酸；然后置于酶标仪上读取450nm处的OD值；以PRL标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制标准曲线并建立回归方程，回归方程为y＝0.139本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测。2.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述鹅PRL重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述鹅PRL多克隆抗体制备方法如下：首先利用鹅PRL重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔获得含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清，然后对获得的含有兔抗鹅PRL多克隆抗体的抗血清进行亲和层析纯化，获得鹅PRL多克隆抗体。4.根据权利要求1鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述生物素标记PRL抗体是通过如下方法获得的：利用碳酸氢钠缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至1mg/mL，获得抗体溶液；然后每1mL抗体溶液中加入120μlN-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液，室温、避光条件下持续搅拌90min；再加入NH4Cl溶液终止反应；将反应液置于10mMPBS缓冲液中透析后，即获得生物素标记PRL抗体。5.如权利要求1-4任一所述鹅催乳素的双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于，所述以鹅PRL多克隆抗体为捕获抗体，生物素标记PRL抗体为检测抗体，鹅PRL重组蛋白作为标准品，进行ELISA定量检测是指：1）用PBS缓冲液将鹅PRL多克隆抗体稀释至5μg/mL，加入酶标板中...

【专利技术属性】
技术研发人员：施振旦，陈蓉，朱欢喜，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32