一种多粘菌素B磁珠、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多粘菌素B磁珠、制备方法及其应用，主要通过将Fe3O4纳米磁珠与多粘菌素B溶液混合后在40～60℃下搅拌2～5h，得到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠，即多粘菌素B磁珠。该多粘菌素B磁珠包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的多粘菌素B。本发明专利技术制备的多粘菌素B磁珠通过特异的多粘菌素B分子聚阳离子环与b型流感嗜血杆菌细胞膜上的脂蛋白游离负电荷的磷酸基通过静电作用相结合，具有准确性高和特异性强的特点。能够从脑积液中快速富集痕量的b型流感嗜血杆菌，达到良好的吸附效果。同时提高了b型流感嗜血杆菌的检测效率和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种多粘菌素B磁珠、制备方法及其应用
本专利技术属于纳米材料和细菌检验
，具体涉及一种多粘菌素B磁珠、制备方法及其应用。
技术介绍
b型流行性感冒嗜血杆菌简称HIB，即b型流感嗜血细菌，是引起幼儿细菌性脑膜炎、肺炎、菌血症等感染性疾病及死亡的主要病原菌之一，严重危害婴幼儿健康。HIB疫苗适用于从2-17月龄的婴幼儿常规免疫接种，预防HIB引起的侵袭性疾病。由于幼儿对免疫接种的吸收率不高、接种效果欠佳等问题，会出现流感嗜血杆菌(HIB)引起的疾病，但目前国内缺乏对HIB疾病的有效监测和对疾病负担的准确评估。因此，对b型流感嗜血杆菌进行快速准确的检测是很有必要的。目前常用于吸附b型流感嗜血杆菌的方法有免疫法及传统的増菌培养法，这些方法能够实现b型流感嗜血杆菌与样品的分离，但増菌过程中存在易污染、浓缩效率低，免疫法成本高等问题。而且患者提供的样本量小、b型流感嗜血杆菌含量较低并且有大量杂菌生长，对b型流感嗜血杆菌(HIB)的分离培养影响较大。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述局限性，本专利技术的目的是提供一种多粘菌素B磁珠、制备方法及其应用，解决传统的培养方法富集b型流感嗜血杆菌，尤其是痕量菌时效率低、出现假阳性的问题。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案予以实现：一种多粘菌素B磁珠，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的多粘菌素B。本专利技术还公开了一种多粘菌素B磁珠的制备方法，其特征在于，包括：将Fe3O4纳米磁珠与多粘菌素B溶液混合后在40～60℃下搅拌2～5h，得到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠，即多粘菌素B磁珠。具体的，所述的多粘菌素B经过预处理后与Fe3O4纳米磁珠混合，多粘菌素B的预处理过程为：将氯甲酸苄酯、乙醚、NaHCO3溶液共同混合在二氯甲烷溶液中，制备反应液；将反应液与多粘菌素B混合，在25～40℃、300～500r/min下搅拌2～4h，分离，获得初步预处理的多粘菌素B；将赖氨酸溶于柠檬酸和柠檬酸钠的混合液中，混合液的pH＝4.8～6.6，再加入DCC和DMAP，室温、200～500r/min下搅拌10～30min，得到活化后的赖氨酸；将活化后的赖氨酸加入到初步预处理的多粘菌素B的溶液中，室温、100～500r/min下搅拌0.5～3h，得到预处理后的多粘菌素B。优选的，所述的多粘菌素B与氯甲酸苄酯的质量比为3：2；氯甲酸苄酯的质量：NaHCO3的质量：乙醚的体积＝1：0.5～1：0.5～2.5，其中，质量的单位为g，体积的单位为ml；所述的赖氨酸、DCC和DMAP的质量比为1：2：0.5；所述的赖氨酸和多粘菌素B的质量比为1.25：1。具体的，初步预处理的多粘菌素B的分离过程为：在混合液中加入柠檬酸和三氯甲烷，离心收集水相，该水相即为初步预处理的多粘菌素B。具体的，经过预处理后的多粘菌素B与Fe3O4纳米磁珠混合后，在40～60℃下搅拌2～5h，得到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠；然后将三甲基碘硅烷溶液混合到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠的去离子水溶液中，室温、50～200r/min下搅拌2～5h，其中，三甲基碘硅烷溶液的体积与Fe3O4纳米磁珠的质量比为2～5:0.5～1，质量的单位为g，体积的单位为ml；最后用饱和氯化钠溶液洗涤至上清液澄清，磁分离，得到多粘菌素B磁珠。具体的，所述的Fe3O4纳米磁珠经过预处理后与多粘菌素B混合，Fe3O4纳米磁珠的预处理过程为：将表面经过羧基改性的Fe3O4纳米磁珠加入到分散液中，在25～40℃、100～500r/min下搅拌0.5～2h，洗涤，得到预处理后的Fe3O4纳米磁珠；其中，分散液由柠檬酸和柠檬酸钠混合液与乙醇按照体积比为2:1的比例混合而成，柠檬酸和柠檬酸钠混合液的pH＝4.8～6.6。具体的，将多粘菌素B溶液和Fe3O4纳米磁珠混合后，再加入NHS和EDC，在40～60℃、100～500r/min下搅拌2～5h，得到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠，即多粘菌素B磁珠；其中，NHS和EDC的总质量为Fe3O4纳米磁珠质量的2～5倍，且NHS与EDC的质量比为3：4。优选的，多粘菌素B与Fe3O4纳米磁珠的质量比为1：2。本专利技术还公开了上述多粘菌素B磁珠或上述的制备方法制备的多粘菌素B磁珠用于吸附b型流感嗜血杆的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术制备的多粘菌素B磁珠通过特异的多粘菌素B分子聚阳离子环与b型流感嗜血杆菌细胞膜上的脂蛋白游离负电荷的磷酸基通过静电作用相结合，具有准确性高和特异性强的特点。能够从脑积液中快速富集痕量的b型流感嗜血杆菌，达到良好的吸附效果。同时提高了b型流感嗜血杆菌的检测效率和灵敏度。(2)本专利技术通过氯甲酸苄酯保护多粘菌素b结构中的氨基，并且在通过赖氨酸引入了氨基基团，增加了多粘菌素B与细菌细胞壁结合的位点，使得吸附效率提高。(3)本专利技术对多粘菌素B与Fe3O4纳米磁珠复合后的多粘菌素B磁珠进行了脱除氨基保护的处理，使多粘菌素B中的氨基基团能够与b型流感嗜血杆菌吸附结合。附图说明图1是实施例1制备的多粘菌素B磁珠的TEM图。图2是实施例1制备的多粘菌素B磁珠吸附细菌后的TEM照片。图3是经过氨基保护(实施例1)和未经氨基保护(对比例1)的多粘菌素B磁珠的粒径和吸附效率。图4是不同赖氨酸与多粘菌素B的质量比条件下制备的多粘菌素B磁珠的吸附效率。图5是不同浓度(0mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM)的赖氨酸、天冬酰胺和丙氨酸修饰多粘菌素B后制备的磁珠的吸附效率。图6是不同质量比的赖氨酸、DCC和DMAP修饰多粘菌素制备的磁珠吸附效率。图7是不同质量比的磁珠与多粘菌素B制备磁珠的粒径及吸附效率。图8是Fe3O4纳米磁珠表面经过羧基改性和羟基改性后制备的多粘菌素B磁珠的吸附效率。图9是经过脱氨基与未脱氨基条件处理后的多粘菌素B磁珠吸附效率。以下结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术做具体说明。具体实施方式本专利技术通过将多粘菌素B修饰到磁性纳米材料表面制备一种能够快速富集样品中痕量b型流感嗜血杆菌的功能性磁珠，从而提高了样品检测结果的阳性率。本专利技术的多粘菌素B磁珠，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的多粘菌素B，从实施例制备的磁珠形貌以及能谱分析可以证实，多粘菌素B包裹在Fe3O4纳米磁珠表面。本专利技术的多粘菌素B磁珠的制备方法，主要包括以下步骤：步骤一：多粘菌素B预处理步骤1.1：将氯甲酸苄酯、乙醚、NaHCO3溶液共同混合在二氯甲烷溶液中，制备反应液，其中，氯甲酸苄酯的质量：NaHCO3的质量：乙醚的体积＝1：0.5～1：0.5～2.5，优选1:0.75:2.5，其中，质量的单位为g，体积的单位为ml；将反应液逐滴加入到多粘菌素B中，在25～40℃、300～500r/min下搅拌2～4h，分离，获得初步预处理的多粘菌素B，对多粘菌素B的氨基基团进行保护；优选的，多粘菌素B与氯甲酸苄酯的质量比为3：2；其中，多粘菌素B的分离过程为：在混合液中加入柠檬酸和三氯甲烷，离心收集水相，该水相即为初步预处理的多粘菌素B。步骤1.2：将赖氨酸溶于柠檬酸和柠檬酸钠的混合液中，混合液的pH＝4.8～6.6，提供中性反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多粘菌素B磁珠，其特征在于，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的多粘菌素B。

【技术特征摘要】
1.一种多粘菌素B磁珠，其特征在于，包括Fe3O4纳米磁珠以及包覆在Fe3O4纳米磁珠表面的多粘菌素B。2.一种多粘菌素B磁珠的制备方法，其特征在于，包括：将Fe3O4纳米磁珠与多粘菌素B溶液混合后在40～60℃下搅拌2～5h，得到表面包覆多粘菌素B的Fe3O4纳米磁珠，即多粘菌素B磁珠。3.如权利要求2所述的多粘菌素B磁珠的制备方法，其特征在于，所述的多粘菌素B经过预处理后与Fe3O4纳米磁珠混合，多粘菌素B的预处理过程为：将氯甲酸苄酯、乙醚、NaHCO3溶液共同混合在二氯甲烷溶液中，制备反应液；将反应液与多粘菌素B混合，在25～40℃、300～500r/min下搅拌2～4h，分离，获得初步预处理的多粘菌素B；将赖氨酸溶于柠檬酸和柠檬酸钠的混合液中，混合液的pH＝4.8～6.6，再加入DCC和DMAP，室温、200～500r/min下搅拌10～30min，得到活化后的赖氨酸；将活化后的赖氨酸加入到初步预处理的多粘菌素B的溶液中，室温、100～500r/min下搅拌0.5～3h，得到预处理后的多粘菌素B。4.如权利要求3所述的多粘菌素B磁珠的制备方法，其特征在于，所述的多粘菌素B与氯甲酸苄酯的质量比为3：2；氯甲酸苄酯的质量：NaHCO3的质量：乙醚的体积＝1：0.5～1：0.5～2.5，其中，质量的单位为g，体积的单位为ml；所述的赖氨酸、DCC和DMAP的质量比为1：2：0.5；所述的赖氨酸和多粘菌素B的质量比为1.25：1。5.如权利要求3所述的多粘菌素B磁珠的制备方法，其特征在于，初步预处理的多粘菌素B的分离过程为：在混合液中加入柠檬酸和三氯甲烷，离心收集水相，该水相即为初步预处理的多粘菌素B。6.如权利要求3所述的多粘菌素B磁珠的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔浪军，陈蓓，申萧蒙，陈雪，黄自华，冯润东，王莉芳，李晓春，张鹏，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61