L-核酸的酶促合成制造技术

本发明专利技术涉及一种用于添加一个或多个L‑核苷酸到第一L‑核酸的3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L‑核苷酸与所述第一L‑核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L‑核苷酸到所述第一L‑核酸的3'端。

【技术实现步骤摘要】
L-核酸的酶促合成本申请为申请日是2013年5月16日、申请号是201380024198.0(PCT/EP2013/001458)、专利技术名称为“L-核酸的酶促合成”的中国申请的分案申请。本专利技术涉及一种用于添加一个或多个L-核苷酸到第一L-核酸的3‘端的方法；一种用于扩增靶L-核酸的方法；一种包含酶活性展现部分的蛋白质；包含氨基酸序列的聚合酶，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸；一种野生型聚合酶的聚合酶变体，其中所述野生型聚合酶由根据SEQIDNO:15的氨基酸序列组成；一种野生型聚合酶的聚合酶变体，其中所述野生型聚合酶由根据SEQIDNO:1的氨基酸序列组成；包含酶活性展现部分的蛋白质在用于添加一个或多个L-核苷酸的方法中的用途；包含酶活性展现部分的蛋白质在用于扩增靶L-核酸的方法中的用途；一种用于鉴别结合靶分子的L-核酸分子的方法；一种用于分别产生所述蛋白质和聚合酶的方法；以及一种用于将第一D-肽或第一D-蛋白质与第二D-肽或第二D-蛋白质彼此连接的方法。基因技术的可利用性在广义上对医学和诊断领域以及基础研究在过去数十年间所取得的进展贡献良多。基因技术所提供的合成力超过了化学合成的合成力。确切地说，基因技术和基因工程允许使用原核细胞和真核细胞的酶机制来产生事实上无限量的L-肽和L-蛋白质。确切地说，酶和聚合酶，或是野生型形式或是这些野生型形式的变体，允许通过连接D-核酸的构筑块(即，D-核苷酸)到化学合成可实现的长度(至少未获得合理的产率)来合成所述D-核酸。由于手性特异性，基因技术中所使用的酶仅能对应地使用手性与其自身的手性相符的构筑块和底物。对应地具有相反手性的构筑块和底物可能不受酶活性影响。由于手性互易原则，对应地具有相反手性的构筑块和底物的处理要求酶也具有相反的手性。举例来说，这种手性互易原则广泛用于产生靶结合L-核酸，这些靶结合L-核酸也是已知的并且称为镜像异构体。迄今为止，镜像异构体都是利用以下方法鉴别：在第一步骤中，使用D-核酸库针对诸如D-肽或D-蛋白质的靶分子或靶结构的对映异构形式进行体外选择。在第二步骤中，将如此鉴别的能结合靶分子或靶结构的对映异构形式的D-核酸制备为对应的L-核酸。由于手性互易原则，这些L-核酸(即镜像异构体)能够结合真实或实际的靶分子，诸如L-肽或L-蛋白质，而不结合用于选择过程的其对映异构形式，诸如D-肽或D-蛋白质。优选地，所述真实的或实际的靶分子或靶结构是诸如人体或动物体的生物学系统中存在的靶分子或靶结构。用于制备所述镜像异构体的方法描述于例如‘TheAptamerHandbook’(Klussmann编,2006)中。使鉴别镜像异构体的方法更容易的一种方式可能是重新设计所述方法，以便使用靶分子或靶结构直接从L-核酸库选择L-核酸，因为对映异构体形式由真实的或实际的靶分子或靶结构展现。由于所述方法的一部分是对最初对应地结合靶分子和靶结构的那些L-核酸进行扩增，故将会需要能添加至少一个核苷酸到L-引物的聚合酶。迄今为止，已知还没有聚合酶由能够这样做的L-氨基酸组成。因此，需要由D-氨基酸组成的聚合酶和类似的酶。由于基因技术不能提供这样的由D-氨基酸组成的功能活性聚合酶，故需要进行化学合成。然而，D-蛋白质或D-多肽的合成仅限于相对较小的分子。迄今合成的最大的D-蛋白质是由102个D-氨基酸组成的血管生成蛋白血管内皮生长因子(缩写VEGF-A)的D-蛋白质形式(Mandal等,2012)，然而，聚合酶通常由超过300个氨基酸组成。因此，本专利技术潜在的问题是提供了一种允许添加至少一个核苷酸到诸如引物的L-核酸的方法。本专利技术的另一个潜在问题是提供了一种使用L-核苷酸扩增靶L-核酸的方法。本专利技术的另一个潜在问题是提供了允许实施这些方法的手段。所附的独立权利要求的主题解决了本专利技术的这些及其它潜在问题。可以根据所附的从属权利要求来进行优选实施方案。在第一方面，也是所述第一方面的第一实施方案中，通过一种用于添加一个或多个L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法也解决了本申请潜在的问题，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L-核苷酸与所述第一L-核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。在所述第一方面的第二实施方案，也是所述第一方面的第一实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。在所述第一方面的第三实施方案，也是所述第一方面的第一和第二实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部分。在所述第一方面的第四实施方案，也是所述第一方面的第一、第二和第三实施方案的一个实施方案中，所述酶活性是聚合酶活性。在所述第一方面的第五实施方案，也是所述第一方面的第四实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性是热稳定的聚合酶活性。在所述第一方面的第六实施方案，也是所述第一方面的第三、第四和第五实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含至少300个氨基酸。在所述第一方面的第七实施方案，也是所述第一方面的第六实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分的氨基酸序列包含介于300和900个之间的氨基酸，优选介于300和600个之间的氨基酸，更优选介于300和360个之间的氨基酸，最优选340至360个氨基酸。在所述第一方面的第八实施方案，也是所述第一方面的第四、第五、第六和第七实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性是DNA聚合酶活性。在所述第一方面的第九实施方案，也是所述第一方面的第八实施方案的一个实施方案中，所述DNA聚合酶活性是DNA依赖性DNA聚合酶活性。在所述第一方面的第十实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述酶活性展现部分是酶。在所述第一方面的第十一实施方案，也是所述第一方面的第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分是聚合酶。在所述第一方面的第十二实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分选自非洲猪瘟病毒聚合酶X、嗜热细菌聚合酶X核心域、大鼠聚合酶β、真核生物聚合酶β、克列诺片段(KlenowFragment)、克列诺外切聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、测序酶、T7DNA聚合酶、SP6聚合酶、DNA聚合酶I、聚合酶λ及其中每一个和任一个的变体，其中所述聚合酶活性展现部分优选为非洲猪瘟病毒聚合酶X或其变体，其由选自以下的氨基酸序列的所选氨基酸序列组成：根据SEQIDNO:1的氨基酸序列、根据SEQIDNO:2的氨基酸序列、根据SEQIDNO:3的氨基酸序列和根据SEQIDNO:4的氨基酸序列。在所述第一方面的第十三实施方案，也是所述第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一实施方案的一个实施方案中，所述聚合酶活性展现部分选自聚合酶DPO4、嗜热高温球菌DNA聚合酶、火球菌属某种DNA聚合酶、激烈火球菌DNA聚合酶、Pfuturbo聚合酶、硫磺矿硫化叶菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于添加一个或多个L‑核苷酸到第一L‑核酸的3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L‑核苷酸与所述第一L‑核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L‑核苷酸到所述第一L‑核酸的3'端。

【技术特征摘要】
2012.05.16 EP 12003887.21.一种用于添加一个或多个L-核苷酸到第一L-核酸的3'端的方法，其中所述方法包括在包含酶活性展现部分的蛋白质存在下使所述一个或多个L-核苷酸与所述第一L-核酸反应的步骤，其中所述酶活性能够添加一个或多个L-核苷酸到所述第一L-核酸的3'端。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶活性展现部分由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列的氨基酸是D-氨基酸。3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述酶活性展现部分是聚合酶活性展现部分。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶活性是聚合酶活性。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·佩什，R·大卫，F·雅罗什，M·雅恩兹，S·克鲁斯曼，
申请(专利权)人：诺松制药股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE