本发明专利技术涉及基因工程领域，具体公开了一种来自烟草的钾转运蛋白KUP9及其编码基因与应用。本发明专利技术首次提供了分离自烟草的KUP9基因，所述KUP9基因全长2370bp，经功能验证，本发明专利技术提供的KUP9基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后，表达所述KUP9基因的重组酵母重新具有了钾离子吸收和转运的功能。因此，本发明专利技术提供的KUP9基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。
【技术实现步骤摘要】
一种来自烟草的钾转运蛋白KUP9及其编码基因与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种来自烟草的钾转运蛋白KUP9及其编码基因与应用。
技术介绍
钾转运体是能在外界钾离子浓度极低时将钾离子转运至细胞内的载体蛋白。钾转运体通常是一些跨膜蛋白，通过构象变化完成钾离子的跨膜转运，是一种需要ATP提供能量的主动运输过程，通常是K+/H+或K+/Na+协同运输。现有技术对于钾转运体基因的研究在模式植物拟南芥中比较广泛，例如，研究表明拟南芥突变体kup6较野生型植株在干旱胁迫下的存活率降低，而35S::KUP6过表达转基因植株的耐旱能力却得到了明显的增强(Shabalaetal.,2007)；而KUP7基因的突变体幼苗在低钾胁迫下表现出叶片黄化的低钾敏感表型，其根部的钾离子含量显著下降，KUP7基因功能的缺失使拟南芥幼苗在低钾条件下对钾的吸收能力降低、木质部汁液中钾离子浓度降低(Minetal.,2016)。烟草是一种耗钾量很大的作物，烟叶钾含量是衡量烟叶品质的的重要指标，目前，对于烟草中钾转运体基因的研究较少，烟草KUP的功能未知。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种来自烟草的钾转运蛋白KUP9及其编码基因与应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供一种钾转运蛋白，获自烟草，命名为KUP9蛋白，是如下(a)或(b)(a)其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；(b)SEQIDNO.1所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收和转运调控相关的由(a)衍生的蛋白质。上述(b)中的KUP9蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的KUP9蛋白的编码基因可通过将SEQIDNO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变而得到。编码所述KUP9蛋白的基因(KUP9基因)也属于本专利技术的保护范围。所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如SEQIDNO.2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。经研究发现，所述KUP9基因在促进钾离子吸收和转运方面发挥明显作用。进一步地，本专利技术所述KUP9基因由以下步骤制备得到：(1)设计PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物：正向引物：5’-ATGACTTCAGGAATGGAAAT-3’，反向引物：5’-TTACACATAAAAGATCTGTC-3’；(2)提取烟草细胞总RNA，合成烟草细胞cDNA，以烟草细胞cDNA为模板进行KUP9基因的PCR扩增，得到目的片段，测序。在本专利技术的一个实施例中，所述的PCR扩增的体系为20μL体系，包括PremixExTaq10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，烟草细胞cDNA1μL，ddH2O8μL。优选的，所述的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35个循环。优选的，所述的目的片段在测序之前还包括，将所述目的片段导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进行测序。优选的，所述菌落PCR验证使用的正向引物核苷酸序列为：5’-ATGACTTCAGGAATGGAAAT-3’，菌落PCR验证使用的反向引物核苷酸序列为：5’-TTACACATAAAAGATCTGTC-3’。优选的，所述菌落PCR验证的体系为10μL，包括PremixExTaq5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH2O4μL。进一步地，含有所述KUP9基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌等生物材料均属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体可用现有的植物表达载体进行构建。所述重组表达载体例如可以是双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用KUP9基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用KUP9基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。携带有所述KUP9基因的重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。进一步地，本专利技术还保护所述KUP9蛋白、所述KUP9基因和含有该基因的所述生物材料在促进植物或微生物钾离子吸收和转运中的应用。所述植物包括烟草、拟南芥，所述微生物包括酵母菌。例如，在本专利技术的具体实施方式中，将所述KUP9基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后，表达所述KUP9基因的重组酵母重新具有了钾离子吸收和转运的功能；将烟草植株中所述KUP9基因进行超量表达后，可显著提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。所述应用可选为，将前述烟草KUP9基因转入到烟草植株中，使KUP9基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。进一步地，本专利技术还保护所述KUP9蛋白、所述KUP9基因和含有该基因的所述生物材料在制备转基因植物中的应用。进一步地，本专利技术还保护所述KUP9蛋白、所述KUP9基因和含有该基因的所述生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的为促进植物钾离子吸收和转运，优选为提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。例如烟草或拟南芥KUP9突变株。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次提供了分离自烟草的KUP9基因，所述KUP9基因全长2370bp，经功能验证，本专利技术提供的KUP9基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后，表达所述KUP9基因的重组酵母重新具有了钾离子吸收和转运的功能。因此，本专利技术提供的KUP9基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。附图说明图1为本专利技术实施例2中酵母功能互补实验结果。其中，A为钾离子浓度为20uM的培养基上的生长情况，B为钾离子浓度为2mM的培养基上的生长情况；图中，1为阴性对照(转入空载体)，2为转入KUP9基因的重组酵母，3为阳性对照转入拟南芥KUP基因的酵母；从左到右依次为原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液在培养基上的生长结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种来自烟草的KUP9蛋白质，其特征在于，是如下(a)或(b)：(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(b)SEQ ID NO.1所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收和转运调控相关的由(a)衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种来自烟草的KUP9蛋白质，其特征在于，是如下(a)或(b)：(a)其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；(b)SEQIDNO.1所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物钾离子吸收和转运调控相关的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)编码区如SEQIDNO.2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与植物钾离子吸收和转运调控相关蛋白的DNA分子。3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾吉凡，任学良，鲁黎明，李立芹，王仁刚，张洁，王自力，郭玉双，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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