本专利描述了涉及具有L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸降解酶活性的蛋白质的工程化的方法和组合物。例如，在某些方面，可公开包含一个或多个氨基酸置换并且能够降解L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸的经修饰的胱硫醚‑y‑裂合酶。此外，本发明专利技术的某些方面提供了使用所公开的蛋白质或核酸来治疗L‑半胱氨酸/L‑胱氨酸相关癌症的组合物和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗胱氨酸尿症患者的人类酶介导的胱氨酸剔除本专利申请要求2016年7月6日提交的美国临时申请号62/359,018的优先权权益，该临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。合作研究协议的缔约方本文公开和要求保护的专利技术是在Aeglea生物治疗公司(AegleaBioTherapeutics,Inc.)和德克萨斯大学系统董事会(TheBoardofRegentsofTheUniversityofTexasSystem)之间的合作研究协议的范围内开发的。专利技术背景1.专利
本专利技术整体涉及医学和生物学领域。更具体地讲，它涉及具有高半胱氨酸/胱氨酸降解活性和适用于人类治疗的稳定性的灵长类动物酶的工程化。甚至更具体地讲，它涉及使用剔除L-胱氨酸和L-半胱氨酸的酶来治疗胱氨酸尿症的组合物和方法。2.相关领域的描述胱氨酸尿症是由编码肾近端小管的胱氨酸和二价氨基酸转运体的SLC3A1和SLC7A9基因突变导致的遗传病，所述突变导致胱氨酸(氨基酸半胱氨酸的二硫化物形式)的异常分泌并在泌尿道中形成胱氨酸结晶/结石。可用于治疗患有遗传病胱氨酸尿症(其中缺陷性肾转运体在肾滤过期间不能重新摄入胱氨酸)的患者的方法很少。胱氨酸(即氨基酸L-半胱氨酸的二硫化物形式)是高不溶性的，并且在胱氨酸尿症患者的泌尿道中达到高浓度，导致形成胱氨酸结晶和结石。减少循环胱氨酸水平的现有疗法部分防止了泌尿道结石形成，但具有限制其用途的显著副作用。
技术实现思路
本专利技术涉及利用工程化的人胱硫醚-γ-裂合酶的方法，所述胱硫醚-γ-裂合酶将胱氨酸有效地转化为半胱氨酸过硫化物，随后分解为游离的半胱氨酸和H2S，从而使该方法成为通过防止肾和泌尿道中的胱氨酸积聚和结石形成来治疗胱氨酸尿症患者的合适疗法。由于胱氨酸是通常由大多数细胞产生的非必需氨基酸，未发现动物模型中的长期胱氨酸剔除会产生毒性。同样，由于该酶由人类序列构成，不可能诱导不利免疫反应。胱氨酸降解治疗剂以非毒性方式消除循环胱氨酸的总水平的能力表明，它是优于现有治疗方案的防止胱氨酸结石形成的实施方案。本专利技术涉及灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的工程化，以使得来自血清的L-胱氨酸和L-半胱氨酸(本文称为L-半胱氨酸/L-胱氨酸)均可有效地降解，并在适用于人类癌症治疗的制剂中提供经修饰的CGL酶。为了开发显示出与天然酶相比低KM和高催化活性kcat的酶，本专利技术人通过修饰所选的氨基酸来改造天然酶，所述修饰产生具有显著改善的酶学性质的酶。因此，本文所述的修饰的CGL酶通过提供新型酶来克服本领域的主要缺陷，与天然酶相比，所述新型酶包含具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解催化活性的人类或灵长类动物多肽序列。因此，这些经修饰的酶可适用于癌症治疗，并具有低免疫原性和改善的血清稳定性。因此，在一个实施方案中，提供了经修饰的多肽，特别是具有L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性的酶变体，所述L-半胱氨酸/L-胱氨酸降解活性来源于涉及胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的灵长类动物酶。例如，酶变体可具有选自SEQIDNO:2-6的氨基酸序列。例如，变体可以来源于人类酶，诸如人类CGL。在某些方面，可存在包含能够降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸经修饰的灵长类动物CGL的多肽。在一些实施方案中，多肽能够在生理条件下降解L-半胱氨酸/L-胱氨酸。例如，多肽可具有至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、105、106s-1M-1或可在其中推导的任何范围的L-半胱氨酸/L-胱氨酸的催化效率(kcat/KM)。未修饰的多肽可以是天然CGL，特别是人类同种型或其他灵长类动物同种型。例如，天然人类CGL可具有SEQIDNO:1的序列。其他天然灵长类动物CGL的非限制性实例包括苏门达腊猩猩(Pongoabelii)CGL(GenbankID:NP_001124635.1；SEQIDNO:7)、食蟹猕猴(Macacafascicularis)CGL(GenbankID:AAW71993.1；SEQIDNO:8)、黑猩猩(Pantroglodytes)CGL(GenbankID:XP_513486.2；SEQIDNO:9)和倭黑猩猩(Panpaniscus)CGL(GenbankID:XP_003830652.1；SEQIDNO:10)。示例性天然多肽包括与SEQIDNO:1或7-10或其片段具有约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或可在其中推导的任何范围)的序列。例如，天然多肽可包含SEQIDNO:1或7-10的序列的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在其中推导的任何范围)。在一些实施方案中，天然CGL可通过一种或多种其他修饰(诸如化学修饰、置换、插入、缺失和/或截短)来进行修饰。在一个特定实施方案中，天然CGL可通过置换来修饰。例如，置换的数量可以为一个、两个、三个、四个或更多个。在其他实施方案中，天然CGL可在底物识别位点或可影响底物特异性的任何位置修饰。例如，经修饰的多肽可在SEQIDNO:1或7-10的氨基酸位置59和/或339对应的氨基酸位置具有至少一个氨基酸置换。在这些实例中，每个序列的第一个甲硫氨酸对应于氨基酸位置1，并且每个氨基酸从其顺序编号。在某些实施方案中，氨基酸位置59和/或339处的置换是苏氨酸(T)或缬氨酸(V)。在特定实施方案中，修饰是选自59T和339V的一个或多个置换。在另一个实施方案中，置换可包括59T置换。在又一个实施方案中，置换可包括另外的339V置换。在一些实施方案中，天然CGL可以是人类CGL。在一个特定实施方案中，置换可包括人类CGL的E59T和E339V的组合(例如，具有SEQIDNO:2、其片段或同源物的氨基酸序列的经修饰的多肽)。在另外的实施方案中，经修饰的多肽可以是苏门达腊猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:3)、食蟹猕猴CGL-TV突变体(SEQIDNO:4)、黑猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:5)或倭黑猩猩CGL-TV突变体(SEQIDNO:6)。上文讨论的经修饰的多肽可表征为与未修饰的多肽(例如，天然多肽)或本文公开的任何多肽序列相比具有一定百分比的同一性。例如，未修饰的多肽可包含天然灵长类动物CGL(即，人类、苏门达腊猩猩、食蟹猕猴、黑猩猩或倭黑猩猩CGL)的至少或多达约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、405个残基(或可在其中推导的任何范围)。经修饰的多肽的未修饰的部分(即，经修饰的多肽的序列，不包括氨基酸59和/或339处的任何置换)和对应的天然多肽之间的同一性百分比可为约、至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或可在其中推导的任何范围)。还设想，与多肽的未本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种治疗患有胱氨酸尿症或具有患上胱氨酸尿症的风险的受试者的方法，包括将治疗有效量的包含分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚‑γ‑裂合酶(CGL)的制剂施用于所述受试者，所述经修饰的灵长类动物胱硫醚‑γ‑裂合酶相对于天然灵长类动物CGL氨基酸序列具有至少两个置换(参见SEQ ID NO:1和7‑10)，所述至少两个置换包括所述天然灵长类动物CGL序列或包含编码所述分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚‑γ‑裂合酶(CGL)的核苷酸序列的核酸的位置59处的苏氨酸和位置339处的缬氨酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.06 US 62/359,0181.一种治疗患有胱氨酸尿症或具有患上胱氨酸尿症的风险的受试者的方法，包括将治疗有效量的包含分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的制剂施用于所述受试者，所述经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶相对于天然灵长类动物CGL氨基酸序列具有至少两个置换(参见SEQIDNO:1和7-10)，所述至少两个置换包括所述天然灵长类动物CGL序列或包含编码所述分离的、经修饰的灵长类动物胱硫醚-γ-裂合酶(CGL)的核苷酸序列的核酸的位置59处的苏氨酸和位置339处的缬氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述酶还包含异源肽段。3.如权利要求2所述的方法，其中所述异源肽段是XTEN肽、IgGFc、白蛋白或白蛋白结合肽。4.如权利要求1所述的方法，其中所述酶偶联至聚乙二醇(PEG)。5.如权利要求4所述的方法，其中所述酶经由一个或多个赖氨酸或胱氨酸残基偶联至PEG。6.如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·斯通，
申请(专利权)人：得克萨斯州大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US
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