一种猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特点是利用物理、化学及生化方法，以及冷冻干燥技术，在保持猪皮的三维立体网状构造不变的前提下，通过脱脂、脱毛、碱处理病毒灭活、脱细胞、交联、后处理、辐照灭菌等有效地彻底清除猪皮中的抗原物质，完整地保留了真皮细胞外基质的形态，提升了材料的物理强度、亲水性、适当的降解性及存储稳定等性能。

【技术实现步骤摘要】
一种猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法
本专利技术属于生物医用材料的加工领域，尤其涉及一种猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法。
技术介绍
近二十年来，治疗皮肤缺损材料的研发进展很快，主要在于两个方向，一是个自体皮或异体捐献皮的处理，另一个是异种皮或器官的处理，包含了牛羊猪动物的皮、肌腱、内脏膜、肠粘膜等。在国内已有数家公司已经取得了相关的注册证并在实际临床使用。猪皮脱细胞真皮基质敷料主要成分是胶原(纤维)，具有良好的物理机械性能、微弱的免疫抗原性、可生物降解性和可吸收性、良好的与细胞相互作用、良好止血性能，它具有真皮模板作用、组织屏蔽作用以及引导组织再生等功能，能及时地封闭创面，防止感染和体液流失，提高创面愈合质量，减轻病人的痛苦以及方便医护人员操作。主要优点有：①可以有效防止创面干燥；②能够促进创伤部位肉芽组织的生长；③有效减少水分丢失；④限制伤口处微生物的繁殖；⑤防止渗出液中蛋白等的流失；⑥可以减轻伤口处疼痛；⑦能够加速浅表烧伤的自愈；⑧减少创面痊愈后瘢痕的形成和增生。猪皮脱细胞真皮基质敷料通过脱细胞和冷冻干燥处理，使基质抗原性极低，利用真皮(胶原纤维)生物相容性优良的特点，保存了真皮组织中绝大部分的有效组织成分和框架结构，最大限度地模拟了人体皮肤的组织结构,可更好地诱导宿主细胞的生长和皮肤胶原的重建。在现有的脱细胞真皮基质材料中，尚存在以下不足：1.手工操作，劳动强度偏大；2.批量生产的基质材料中可能存在毛根及其它杂质；3.物理强度低，因为戊二醛交联剂毒性高，用量不能高，处理时间也不能久，不能超过2小时，过高过久会造成材料变黄变脆，因而正常时候充当消毒杀菌的作用，处理时间约30min，而这个时间太短，根本不能达到实际的交联提升物理强度的效果，而物理强度低会造成材料易在拉伸过程撕裂，易在覆盖创面治疗过程中降解破碎，结痂后因碎解原因脱落不完全，厚度也不够均匀，使用后易腐烂异味；4.湿态存储不安全，需要加入防腐剂等保存。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特点是采用健康猪皮为原料，使用物理、化学及生化方法，以及冷冻干燥技术，制备出良好生物相容性、适当的物理强度、良好保湿性和干态存储的脱细胞真皮基质材料。本专利技术具体的技术方案如下:猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法,包含如下步骤，其中所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重皮的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的称重皮重×百分数：(1)选取检疫合格的生态猪，经屠宰剥皮后，修剪边缘，并去除多余浮肉，至油窝显露为止。作为优选，所述生态猪为健康、育龄3～6月的生态猪。去除多余浮肉时，在液压去肉机上进行。(2)充分用水清洗，沥干后称重，在正反面涂抹食盐进行防腐，初步破坏细胞，包装后置于冰柜中保藏，然后对这些皮转鼓中依次进行后续工艺处理。作为优选，食盐的用量为，总猪皮重量的10～20％；冰柜的温度为低于－4℃。(3)浸水清洗。作为优选，浸水清洗的工艺具体是：生产前除掉猪皮上的大块盐分，放在28～32℃饮用水中浸泡解冻，使之恢复舒展状态。将猪皮放置于控温转鼓中，加入水300％，匀速转动20～40min，控干废液，反复3～5次。设置转鼓温度30～32℃，加入水250％，平平加0.1～0.5％，食盐1～5％，匀速转动60～120min，控干。用流水清洗10min，控干。(4)使用脱脂剂进行化学脱脂。作为优选，使用脱脂剂进行化学脱脂的工艺具体是：设置转鼓温度30～32℃，加入水150％，平平加1～3％，脱脂剂1～5％，匀速转动60～120min，控干废液。并使用水闷洗10～15min排尽废液2次。上述过程反复3次。(5)使用脱毛酶进行酶脱毛，并进行碱处理。作为优选，具体是：沥干水分，将脱毛酶5～10％，均匀的涂抹于皮张的肉面上，出水后肉面对肉面放置于25～30℃恒温室中8～24h。推去皮上的针毛和绒毛后流水冲洗10～15min。加入水30％，Na2S0.5～2％，NaOH0.5～1.5％，匀速转动60～90min，待毛根基本溶解完全后，加入水220～270％，匀速转动90～120min，控干废液。流水冲洗，至废液pH值为9.0～9.5。设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl1～3％，平平加0.5～3％，匀速转动30～90min，至废液pH值为6.5～7.5控干。再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。(6)使用生化胰酶进行脱细胞处理。作为优选，使用生化胰酶进行脱细胞处理的工艺具体为：设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，生化胰酶0.05～0.1％，平平加0.4～0.6％，匀速转动30～90min，控干废液。再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。(7)交联改性。配制150～200％pH＝10.5的NaHCO3-NaOH缓冲液。设置转鼓温度35～40℃，加入缓冲液50～100％，匀速转动10～30min，排尽。加入缓冲液100％，GPE5～20％，三乙醇胺1～3％，匀速转动24～72h。在交联液中加入甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液。本专利技术之所以使用GPE作为交联剂，具体原因是：交联采用化学方法，其特点：利于降低抗原性，改善物理机械性能，降低生物降解性。本专利技术创新性地采用GPE作为交联剂，GPE属于一种新型的含有环氧基的改性剂，相比于戊二醛交联剂讲，细胞毒性更低，具有更好的细胞亲和力，更有利于内皮细胞的生长；而其后添加的甘氨酸，又名氨基乙酸，是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必需的一种氨基酸，用甘氨酸有以下优点：可与未反应的交联剂反应，开环并产生羟基，使得水溶性大大提高，在后续的清洗中易被洗除，从而可以有效减少了交联剂的残留。甘氨酸本身属于最基本的氨基酸，易溶于水，可温和调节材料的酸碱性，对人体也没危害。(8)后处理。作为优选，后处理的具体工艺为：再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl1～3％，平平加0.5～3％，匀速转动40～60min，至废液pH值为7.0～7.5控干废液。再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干。设置转鼓温度32～36℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液，用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次后重复添加甘氨酸1次。(9)末道清洗，保湿。作为优选，具体工艺为：设置转鼓温度35～40℃，使用纯化水100～300％闷洗2～6次，每次10～30min，再使用注射用水100～300％闷洗2～15次后流水冲洗10～60min，至取上清液滴加AgNO3滴定液数滴无明显白色沉淀为止，控干。加入注射用水100％，甘油1～20％，乳酸钠1～20％，作为优选，乳酸钠1-6％，匀速转动30～60min，控干。(10)冻干成型。将材料送至冷冻干燥机中冻干8～24h。设置恒温恒湿箱温度30～38℃，湿度85～95％，回软1～4h后，在精密剖层机上剖出厚度0.3～1.0mm的材料。在净化工作台上按尺寸要求进行分割，或在激光机上打上圆孔或网孔。(11)包装灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法,包含如下步骤，其中所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重皮的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的称重皮重×百分数：(1)选取检疫合格的生态猪，经屠宰剥皮后，修剪边缘，去除多余浮肉，至油窝显露为止；(2)充分用水清洗，沥干后称重，在正反面涂抹食盐进行防腐，初步破坏细胞，包装后将其置于冰柜中保藏，然后对这些皮在转鼓中依次进行后续工艺处理；(3)浸水清洗；(4)使用脱脂剂进行化学脱脂；(5)使用脱毛酶进行酶脱毛，并进行碱处理；(6)使用生化胰酶进行脱细胞处理；(7)交联改性：配制150～200％pH＝10～11的NaHCO3‑NaOH缓冲液；设置转鼓温度35～40℃，加入缓冲液50～100％，匀速转动10～30min，排尽；加入缓冲液100％，GPE 5～20％，三乙醇胺1～3％，匀速转动24～72h；在交联液中加入甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液；(8)后处理；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl 1～3％，平平加0.5～3％，匀速转动40～60min，至废液pH值为7.0～7.5控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度32～36℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液，用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次后重复添加甘氨酸1次；(9)末道清洗，保湿；(10)冻干成型：将材料送至冷冻干燥机中冻干8～24h；设置恒温恒湿箱温度30～38℃，湿度85～95％，回软1～4h后，在精密剖层机上剖出厚度0.3～1.0mm的材料；按尺寸要求进行分割，或在激光机上打上圆孔或网孔；(11)包装灭菌：将产品包装好，并使用钴60所产生的γ射线辐照灭菌。...

【技术特征摘要】
1.猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法,包含如下步骤，其中所述原辅材料的用量％除特殊说明外，均表示为被处理的称重皮的重量百分数，即原辅材料重量＝被处理的称重皮重×百分数：(1)选取检疫合格的生态猪，经屠宰剥皮后，修剪边缘，去除多余浮肉，至油窝显露为止；(2)充分用水清洗，沥干后称重，在正反面涂抹食盐进行防腐，初步破坏细胞，包装后将其置于冰柜中保藏，然后对这些皮在转鼓中依次进行后续工艺处理；(3)浸水清洗；(4)使用脱脂剂进行化学脱脂；(5)使用脱毛酶进行酶脱毛，并进行碱处理；(6)使用生化胰酶进行脱细胞处理；(7)交联改性：配制150～200％pH＝10～11的NaHCO3-NaOH缓冲液；设置转鼓温度35～40℃，加入缓冲液50～100％，匀速转动10～30min，排尽；加入缓冲液100％，GPE5～20％，三乙醇胺1～3％，匀速转动24～72h；在交联液中加入甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液；(8)后处理；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度30～32℃，加入纯化水100％，NH4Cl1～3％，平平加0.5～3％，匀速转动40～60min，至废液pH值为7.0～7.5控干废液；再使用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次，控干；设置转鼓温度32～36℃，加入纯化水100％，甘氨酸0.1～2％，匀速转动30～90min,控干废液，用纯化水100～300％闷洗10～30min2～3次后重复添加甘氨酸1次；(9)末道清洗，保湿；(10)冻干成型：将材料送至冷冻干燥机中冻干8～24h；设置恒温恒湿箱温度30～38℃，湿度85～95％，回软1～4h后，在精密剖层机上剖出厚度0.3～1.0mm的材料；按尺寸要求进行分割，或在激光机上打上圆孔或网孔；(11)包装灭菌：将产品包装好，并使用钴60所产生的γ射线辐照灭菌。2.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，原料猪皮应为新鲜的，无重大疾病或传染病史的猪皮，如屠宰后4h内能送达生产现场则按冷却形式即温度控制为0～3℃运输，不能送达的进行盐腌防腐后并使用按冻结形式即温度控制为不低于-15℃冷链运输。3.根据权利要求1所述猪皮脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特征在于，所使用的转鼓为不锈钢恒温控速转鼓。4.根据权利要求1所述猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄盛，丛亮亮，刘汝诚，
申请(专利权)人：江阴奔翔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32