马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法技术

一种马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法，本发明专利技术属于代谢组学技术领域，包括：对马铃薯样品进行提取，提取包括：将马铃薯样品与萃取剂以及内标物质混合，然后进行超声萃取制得萃取混合液；萃取剂为水和/或有机溶剂，有机溶剂为甲醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。一种马铃薯代谢组分的分析方法，其包括：将上述的马铃薯代谢组分样品前处理制得的马铃薯代谢组分样品进行GC－MS分析。解决现有技术中代谢组学分析存在灵敏度低、分辨率不高以及高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法
本专利技术属于代谢组学
，具体而言，涉及一种马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法。
技术介绍
代谢物整体水平的检测分析必须依赖分析化学中的各种谱学技术，包括磁共振波谱、质谱、色谱、红外和拉曼光谱、紫外－可见光谱等及其偶合联仪方法获取代谢组数据；在代谢组学的研究中最常见的分析工具是NMR，特别是H－NMR，能够实现对样品的非破坏性、非选择性分析，但它也有两个非常明显的缺陷：灵敏度低、分辨率不高，常常导致高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法，旨在至少解决现有技术中代谢组学分析存在灵敏度低、分辨率不高以及高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物的技术问题。本专利技术是这样实现的：第一方面，本专利技术实施例提供一种马铃薯代谢组分样品前处理，包括对马铃薯样品进行提取，提取包括：将马铃薯样品与萃取剂以及内标物质混合，然后进行超声萃取制得萃取混合液；萃取剂为水和/或有机溶剂，有机溶剂为甲醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。上述技术方案中，通过单因素法和正交试验设计法优化研究了提取代谢产物的因素，确定萃取剂种类对萃取结果的影响，以便于确定使用哪种萃取剂可得到较佳的萃取信息；加入内标物质目的是抵消上样体积，乃至流动相、检测器对实验结果的影响。在一些具体的实施方案中，有机溶剂为甲醇；可选的，当萃取剂为水和有机溶剂时，甲醇体积百分数为50－80％。上述技术方案中，由于水在提取氨基酸和糖方面有很大的优势，因此，在有机溶剂中加入一定比例的水，可以获得更丰富的代谢产物信息，而有机溶剂中，甲醇提取效果最好，水－甲醇混合体系萃取剂萃取过程中可以获得更丰富的代谢产物信息。在一些具体的实施方案中，其中每100mg的马铃薯样品，采用300－800μL萃取剂以及5－15μL内标物质进行混合。上述技术方案中，萃取剂过少则萃取不到足够的样品信息，萃取剂过多则容易造成萃取剂浪费，内标物质价格相对昂贵，加入过多对实验结果改进并不明显，因此适宜的用量至关重要。在一些具体的实施方案中，超声萃取的温度为25－65℃、时间为3－11min。上述技术方案中，一方面，提高提取时间和温度有利于提高代谢物的传质速率，提高代谢物的提取率。另一方面，提取时间和温度的大幅度增加导致了样品中初级代谢物的减少，时间和温度之间的相互作用也需要研究。在一些具体的实施方案中，提取还包括：将萃取混合液在0－10℃下进行离心处理得到离心混合物，离心时间为5－15min，离心转速为10000－15000rmp，然后将离心后180－250μL上清液进行冷冻干燥。上述技术方案中，高速离心处理，悬浮液中的固体颗粒与液体分开，取上清液，使马铃薯样品中的大颗粒与待测样品分离，冷冻干燥避免待测样品受到微生物细菌的影响。在一些具体的实施方案中，提取之后还包括对提取得到的马铃薯样品进行衍生化处理，衍生化处理包括：采用第一衍生化试剂对马铃薯样品进行肟化处理，将肟化后的马铃薯样品与第二衍生化试剂进行硅烷化反应；可选的，每提取100mg的马铃薯样品切片，采用20－40μL的第一衍生化试剂进行肟化处理以及采用20－40μL的第二衍生化试剂进行硅烷化反应；和/或，第一衍生化试剂为甲氧胺盐酸盐吡啶溶液，第二衍生化试剂为N，O－双(三甲基硅基)三氟乙酰胺。上述技术方案中，肟化处理的目的是稳定羰基，抑制羰基的酮－烯醇式互变，或抑制羰基转化成缩酮或缩醛结构。衍生化处理可提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定。硅烷化反应将硅烷基引入到分子中，取代活性氢。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性，减少了氢键束缚。由于含活性氢的反应位点数目减少，化合物的稳定性也得以加强。硅烷化化合物极性减弱，被测能力增强，热稳定性提高。在一些具体的实施方案中，肟化处理的温度为35－40℃、时间为0.8－1.2h；和/或，硅烷化反应的温度为65－75℃、时间为0.8－1.2h。上述技术方案中，硅烷化衍生物较容易挥发，因此硅烷化反应的温度以及肟化处理设定不宜过高，避免硅烷化衍生物挥发。在一些具体的实施方案中，提取前还包括样品预处理，样品预处理包括：将马铃薯样品切片至每块直径为50－80mm，厚度为1－3mm，重量为80－120mg，然后置于液氮中冷冻，－100－－70℃条件下储存。上述技术方案中，由于液氮具有化学惰性，可以直接和样品切片接触，立即冷冻而不会破坏样品的生物活性，因此可以用于保存切片组织，生物样品的储存。液氮冷冻可以最大限度的保存样品中代谢组分不发生改变或者进一步代谢。第二方面，本专利技术实施例提供一种马铃薯代谢组分的分析方法，其包括：将上述的马铃薯代谢组分样品前处理制得的马铃薯代谢组分样品进行GC－MS分析。上述技术方案中，GC增强其分辨能力，与MS的联用可以得到代谢组分的结构信息。具有灵敏度高、分辨率高，避免高丰度的分析物掩盖低丰度的分析物的优点。在一些具体的实施方案中，GC－MS分析中选用HP－5ms色谱柱，参数设定为：进样口温度250－300℃，EI离子源温度200－250℃，四极杆温度120－180℃，载气为高纯氦气，不分流进样，进样量为0.8－1.2μL；采用程序升温，升温程序为：初始温度为60－100℃，保持1－3min；以5－15℃/min升至300－350℃，保持4－10min；在初始温度下保持平衡4－10min，然后再注入下一次样品；载气流速为0.8－1.5mL/min；采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50－550(m/z)。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术试验例1提供的萃取剂种类对超声提取效果的影响统计数据图；图2为本专利技术试验例2的超声提取时间对超声提取效果的影响统计数据图；图3为本专利技术试验例2提供的超声提取温度对超声提取效果的影响统计数据图；图4为本专利技术试验例4提供的马铃薯块茎代谢产物的GC－MS全离子流色谱图；图5为本专利技术试验例5提供的马铃薯块茎中代谢产物的精确度数据统计图；图6为本专利技术试验例5提供的马铃薯块茎中代谢产物的重复性数据统计图；图7为本专利技术试验例5提供的马铃薯块茎中代谢产物的稳定性数据统计图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的马铃薯代谢组分样品前处理及其分析方法进行具体说明。第一方面，本专利技术实施例提供一种马铃薯代谢组分样品前处理，包括对马铃薯样品进行提取，提取包括：将马铃薯样品与萃取剂以及内标物质混合，然后进行超声萃取制得萃取混合液；萃取剂为水和/或有机溶剂，有机溶剂为甲醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。可选的，在一些实施例中，萃取剂仅为水，仅为有机溶剂，或者为水和有机溶剂的混合液。在本专利技术的实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，包括对马铃薯样品进行提取，提取包括：将所述马铃薯样品与萃取剂以及内标物质混合，然后进行超声萃取制得萃取混合液；所述萃取剂为水和/或有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，包括对马铃薯样品进行提取，提取包括：将所述马铃薯样品与萃取剂以及内标物质混合，然后进行超声萃取制得萃取混合液；所述萃取剂为水和/或有机溶剂，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇和乙腈中的至少一种。2.根据权利要求1所述的马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇；可选的，当所述萃取剂为水和所述有机溶剂时，甲醇体积百分数为50－80％。3.根据权利要求1所述的马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，其中每100mg的所述马铃薯样品，采用300－800μL所述萃取剂以及5－15μL所述内标物质进行混合。4.根据权利要求1所述的马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，超声萃取的温度为25－65℃、时间为3－11min。5.根据权利要求1所述的马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，提取还包括：将所述萃取混合液在0－10℃下进行离心处理得到离心混合物，离心时间为5－15min，离心转速为10000－15000rmp，然后将所述离心后180－250μL上清液进行冷冻干燥。6.根据权利要求1－5任一项所述的马铃薯代谢组分样品前处理，其特征在于，提取之后还包括对提取得到的所述马铃薯样品进行衍生化处理，衍生化处理包括：采用第一衍生化试剂对所述马铃薯样品进行肟化处理，将肟化后的所述马铃薯样品与第二衍生化试剂进行硅烷化反应；可选的，每提取100mg的所述马铃薯样品切片，采用20－40μL的所述第一衍生化试剂进行肟化以及采用20－...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽媛，于润众，于英博，王长远，张东杰，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23