一种D-塔格糖联产乙醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种D‑塔格糖联产乙醇的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以以乳糖为底物，β‑半乳糖苷酶和L‑阿拉伯糖异构酶为催化剂，得到包含D‑塔格糖的混合糖液，再利用酿酒酵母消耗混合糖液中的D‑葡萄糖和D‑半乳糖发酵生成乙醇，所述L‑阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术具有生产工艺简单，成本低，底物实现了全值化利用，产物易于分离纯化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种D-塔格糖联产乙醇的方法
本专利技术涉及一种D-塔格糖联产乙醇的方法，具体涉及一种以乳糖或乳清溶液为原料，以β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶活力保存、但葡萄糖酵解途径的酶活力丧失的重组大肠杆菌为生物催化剂生产D-塔格糖，以及以酿酒酵母发酵生产乙醇的方法。
技术介绍
D-塔格糖是D-半乳糖的同分异构体，属于一种稀有的己酮糖。因为其具有蔗糖92％的甜度，但卡路里只有蔗糖的30％，且血糖指数很低(葡萄糖的3％、蔗糖的4.4％)，在摄入人体后不易导致血糖升高，因此常被添加到低糖低热量食品中。2001年，美国食品药品监督管理局(FDA)将D-塔格糖确定为公认安全食品(GRAS)。D-塔格糖的生产多以D-半乳糖为底物，在L-阿拉伯糖异构酶(L-AI，EC5.3.1.4)或者含有L-AI的重组细胞的催化下异构化为D-塔格糖。为了降低成本，在生物催化法生产D-塔格糖时，以价格较为低廉的乳糖或者乳清为原料更为经济。乳糖经β-半乳糖苷酶水解可得到D-半乳糖和D-葡萄糖，其中的D-半乳糖经L-AI催化可生产D-塔格糖。但是，以乳糖为底物利用生物催化法生产D-塔格糖时，产物是D-葡萄糖、D-半乳糖和D-塔格糖的混合物。由于这三种单糖结构类似，致使D-塔格糖的分离纯化非常复杂。将混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖转化成与D-塔格糖结构差异较大的产物，是一种简单可行的分离纯化方法。现有技术都是利用外源表达β-半乳糖苷酶和L-AI的重组微生物实现乳糖至D-塔格糖的生产。利用只外源表达L-AI的重组大肠杆菌粗酶液实现乳糖至D-塔格糖生产的方法未见报道。现有技术没有重视混合糖液中D-塔格糖的分离纯化，更没有重视D-葡萄糖和D-半乳糖的高值化利用，致使D-葡萄糖在生物催化过程中被微生物细胞进一步代谢为多种发酵产物，这不仅造成碳源浪费，也使得D-塔格糖的分离纯化更为复杂。将混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖选择性转化成某一特定高附加值产品或大宗化学品，同时D-塔格糖不被消耗的方法未见报道。
技术实现思路
针对已报道的制备方法中D-塔格糖得率低、产物分离纯化困难、以及混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖未能高值化利用的问题，本专利技术要解决的问题是利用含L-AI的重组大肠杆菌粗酶液催化乳糖或者乳清生产D-塔格糖且不代谢混合糖液中的D-葡萄糖，之后利用酿酒酵母发酵混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖生成乙醇且不代谢D-塔格糖。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种D-塔格糖联产乙醇的方法，以乳糖或乳清(乳清中含有大量乳糖)为底物，β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶为催化剂，得到含有D-塔格糖的混合糖液，该混合糖液中还含有D-葡萄糖和D-半乳糖，再利用酿酒酵母将混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖发酵生成乙醇；其中，所述L-阿拉伯糖异构酶来源于耐热微生物，L-阿拉伯糖异构酶最适温度高于50℃，L-阿拉伯糖异构酶在45～65℃热稳定性良好。所述的L-AI优选来源于嗜热芽孢杆菌CCTCCNo.M2011468或凝结芽孢杆菌DSMNo.23183并将其279位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸的L-AIF279I。本专利技术中使用的β-半乳糖苷酶为大肠杆菌内源酶，本专利技术将得到的粗酶液置于45～65℃水浴中处理0.5～5小时后，仍然可以得到D-塔格糖，说明该酶在45～65℃热稳定性良好，仍然能够催化乳糖分解为D-葡萄糖和D-半乳糖。所述D-塔格糖联产乙醇的方法具体包括如下步骤：(1)培养表达L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)；(2)制备包含β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶的粗酶液；(3)对步骤(2)得到的粗酶液进行热变性处理，使β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶保存活力，而重组大肠杆菌BL21(DE3)中参与葡萄糖酵解途径的酶活力丧失，得到催化剂；(4)以乳糖或者乳清为底物，步骤(3)得到的含有β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶的粗酶液为催化剂，制备含有D-葡萄糖、D-半乳糖和D-塔格糖的混合糖液；(5)利用酿酒酵母将混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖发酵生成乙醇，同时保留D-塔格糖。其中，所述L-阿拉伯糖异构酶来源于耐热微生物，L-阿拉伯糖异构酶最适温度高于50℃，L-阿拉伯糖异构酶在45～65℃热稳定性良好。步骤(1)中，所述重组大肠杆菌BL21(DE3)的构建方法如下：将L-阿拉伯糖异构酶核苷酸序列克隆到表达质粒中，L-阿拉伯糖异构酶核苷酸序列优选SEQIDNO.1所示的序列，所述表达质粒为pETDuet-1，得到重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，既得到所述重组大肠杆菌BL21(DE3)。步骤(3)中，所述的热变性步的方法如下：取步骤(2)制得的粗酶液置于45～65℃水浴中处理0.5～5小时，热变性温度优选为50～55℃，热变性处理时间优选为1～2小时。步骤(4)中，底物乳糖的浓度为40～400g/L(底物或者为乳糖含量为40～400g/L的乳清溶液)，乳糖浓度优选为100～200g/L，L-阿拉伯糖异构酶的活力为6～16U/g乳糖，L-阿拉伯糖异构酶添加量优选为10～14U/g乳糖，催化温度为45～65℃，pH值为5.5～8.0，pH值优选为6.0～6.5，反应体系中Mn2+或者Co2+浓度为1mM，催化时间为0.5～12小时。步骤(5)中，所述的酿酒酵母能发酵D-葡萄糖和D-半乳糖为乙醇，但不能代谢D-塔格糖。步骤(5)中，在混合糖液中添加0.8～1.6g/L硫酸铵、0.2～0.6g/L氯化锌、0.2～0.6g/L硫酸镁和0.7～1.3g/L氯化钙，优选在混合糖液中添加1.2g/L硫酸铵、0.4g/L氯化锌、0.4g/L硫酸镁和1g/L氯化钙，接入酿酒酵母CCTCCAY2018004至初始菌体浓度为OD600＝10，发酵过程初始pH为6.0，发酵温度为30℃。有益效果：(1)重组大肠杆菌只需要外源表达L-AI，操作简单。(2)以价格低的乳糖或者乳清为底物生产D-塔格糖，成本低。(3)D-塔格糖得率高。(3)乳糖水解产物不被大肠杆菌代谢，有利于后续分离纯化。(4)乳糖水解产物不被大肠杆菌代谢，可后续用于乙醇生产，实现了底物的全值化利用。(5)酿酒酵母选择性发酵D-葡萄糖和D-半乳糖为乙醇，有利于后续分离纯化。附图说明图1是生物催化剂制备过程示意图。图2是以乳清为原料，D-塔格糖和乙醇联产工艺流程示意图。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不限制权力要求书中所详细描述的本专利技术。以下实施例中乳糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-塔格糖产量的检测方法如下：采用Agilent1200液相色谱仪，配备Sugar-pak1(6.5×300mm，Waters)分离柱，柱温80℃，流动相为去离子水，流速0.4mL/min，进样量10μL，采用示差折光检测器，检测器控温35℃。以下实施例中乙醇产量的检测方法如下：采用Agilent1200液相色谱仪，配备Bio-RadAminexHPX-87H(7.8×300mm，Agilent)分离柱，柱温55℃，流动相为5mMH2SO4，流速0.6mL/min，进样量10μL，采用示差折光检测器。以下实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D‑塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，以乳糖为底物，β‑半乳糖苷酶和L‑阿拉伯糖异构酶为催化剂，得到包含D‑塔格糖的混合糖液，再利用酿酒酵母消耗混合糖液中的D‑葡萄糖和D‑半乳糖发酵生成乙醇。

【技术特征摘要】
1.一种D-塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，以乳糖为底物，β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶为催化剂，得到包含D-塔格糖的混合糖液，再利用酿酒酵母消耗混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖发酵生成乙醇。2.根据权利要求1所述的D-塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，所述L-阿拉伯糖异构酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述D-塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培养表达L-阿拉伯糖异构酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)；(2)制备包含β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶的粗酶液；(3)对步骤(2)得到的粗酶液进行热变性处理，使β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶保存活力，而重组大肠杆菌BL21(DE3)中参与葡萄糖酵解途径的酶活力丧失，得到催化剂；(4)以乳糖或者乳清为底物，步骤(3)得到的含有β-半乳糖苷酶和L-阿拉伯糖异构酶的粗酶液为催化剂，制备含有D-葡萄糖、D-半乳糖和D-塔格糖的混合糖液；(5)利用酿酒酵母将混合糖液中的D-葡萄糖和D-半乳糖发酵生成乙醇，同时保留D-塔格糖。4.根据权利要求3所述的D-塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，所述L-阿拉伯糖异构酶最适温度高于50℃。5.根据权利要求3所述的D-塔格糖联产乙醇的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组大肠杆菌BL21(DE3)的构建方法如下：将L-阿拉伯糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑兆娟，谢佳笑，欧阳嘉，刘鹏，勇强，徐勇，李鑫，朱均均，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32