一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法技术

本发明专利技术涉及生物分析方法领域，具体地涉及一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，使用气相色谱‑质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。代谢组学的数据显示酵母培养物的饲喂，盲肠差异代谢产物主要涉及氨基酸代谢、胆固醇代谢，并且参与脂肪、维生素消化和吸收过程。

【技术实现步骤摘要】
一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法
本专利技术涉及生物分析方法领域，具体地涉及一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法。
技术介绍
生物体内数以万亿计的微生物群落与其寄生的宿主保持着互惠共生的关系。这些微生物拥有超过人类基因组的几百倍的基因编码，其基因总和为“微生物组”。而肠道微生物菌群就是近代学者们发现的一个富含微生物群的微生物组。有关肠道菌群的研究已经是当今的一个热门领域。它与许多疾病如代谢类综合症、肥胖等发生和发展都密切相关。肠道菌群是通过影响宿主的代谢能力和免疫能力，从而影响宿主的健康。因此，探究酵母培养物这类微生态制剂对鸡肠道微生物菌群及其代谢物的影响，进一步推进对酵母培养物保健作用机制的理解，对研究家禽肠道微生物区系，改善肠道健康和预防疾病起到指导作用。肠道微生物的功能包括：营养代谢功能及抑菌作用、生物屏障免疫功能和促进生长发育功能。传统的研究肠道微生物的方法是纯培养，主要是通过提供一些必要的营养和存活条件来维持微生物的正常生长，如平板培养。但肠道中寄生的微生物大多为厌氧型，且种类繁多，另有报道约100-1000多种细菌很难甚至不可培养，因此传统的培养方式已经不能满足研究的需要。酵母及其培养物的研究及应用始于19世纪20年代，在动物生产中受到了业界广泛青睐。酵母培养物营养丰富、成分复杂，主要由酵母代谢产物、活酵母菌、培养基3大部分组成。多年科学研究和生产应用实践证明，酵母培养物是通过其代谢产物来调节动物胃肠道中微生物区系的数量和平衡，提高动物的生产力水平，优化饲料营养价值，调节消化道微生态、改善动物健康状态。随着代谢组学的发展，肠道内环境研究方法己逐渐被用于系统地研究不同环境、营养水平队及肠道菌群的改变对动物机体代谢物的变化。当饲养环境、日粮结构及和营养水平等发生变化以后，肠道内的代谢产物也会随之发生变化。利用代谢组评价不同饲粮对动物生长代谢的影响，在小鼠、猪和牛等方面的试验较多，但在家禽方面的研究却相对较少。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述技术问题的不足，提供了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，利用GC/MS的代谢组学方法研究肉鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物变化，以及对其代谢通路的影响。最后对42日龄肉鸡盲肠内容物进行了检测，最终共检测并确认盲肠内容物中86种不同代谢物，随后通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的代谢通路，找到与差异代谢产物相关的信息。解决上述技术问题的技术方案如下：本专利技术设计了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，使用气相色谱-质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。所述的气相色谱-质谱联用的检测条件为：气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温70℃，保留5min，以4℃/min升温至100℃，保持5min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8min；以10℃/min升温至270℃，保持5min；载气为99.999％高纯He；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min；进样量1μL；分流比50：1，溶剂延迟时间3min；质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；质量范围20～800amu。所述的不同发酵时间产出的酵母培养物是由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供的发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h的五种酿酒酵母培养物和达农威中国有限公司提供的达农威益康VXP。所述的盲肠内容物在进入气相色谱-质谱联用仪之前需要前处理，处理的步骤为：称取冻干样品0.05g，将样品于1mLPE管中，分别加入100μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，混合时使用漩涡振荡器震荡30s，然后放于37℃水浴锅中肟化反应90min；取出后加入含1％TMCS的BSTFA衍生试剂200μL，于70℃反应60min；衍生结束后，分别将各组样品进行离心，10000r/min离心10min，取上清液100ul，转移至GC瓶中，加入400uL正己烷定量至500uL，采取自动进样模式，进入气相色谱-质谱联用仪进行分析。所述的分析为：待测样品进行GC-MS检测，在获得TIC图后对各色谱峰成分进行识别鉴定；GC-MS检测获得的原始数据通过GC-MS仪器工作站软件Xcalibur1.2版本由RAW格式转化为netCDF格式，使用美国安捷伦公司，用于拆分TIC中的重叠峰的软件NISTAMDIS程序，对数据进行预处理，主要有降噪、保留时间校正、峰对齐和反卷积等数据标准化分析等。并且依据峰在GC/MS总离子流图中的保留时间，选择图谱中共有的色谱峰，将质谱图中检测化合物以及其保留指数通过NIST11库中作对比，完成峰的鉴别。选择保留指数和标准品的保留时间库中可能性>70％的化合物为鉴定化合物。还包括多元统计分析步骤，具体为：将GC/MS标准化数据矩阵，即鉴定的代谢物名称和色谱峰面积校正结果，导入SIMCA-P+14.1.0软件(UmetricsAB,Sweden)软件，进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析；采用PCA主成分分析的方法来评价组间样本的分布状况，通过OPLS-DA模型及其模式下的S-Plot寻找到的代谢差异物，生物标志物筛选的标准为变量权重重要性排序VIP＞1，且t-检验的P＜0.05；利用KEGG数据库查询生物标志物的代谢通路。本专利技术的有益效果是：本专利技术思路清晰，建立了一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法。对42日龄肉鸡盲肠内容物进行了检测，最终共检测并确认盲肠内容物中86种不同代谢物，随后通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中的代谢通路，找到与差异代谢产物相关的信息。本专利技术着重比较生产性能差异较大的两组盲肠内容物，分别为饲喂发酵24h和60h的酵母培养物。两组肉鸡盲肠内容物中共有6种差异代谢产物发生显著性变化，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸、呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇。两组差异代谢物质比较，丙氨酸、亮氨酸、苯乙酸含量升高；呋喃甘露糖、阿拉伯糖醇、胆固醇含量下降。这些物质主要涉及以下典型代谢途径苯丙氨酸代谢、丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢、胆固醇代谢、甾体激素合成、脂肪消化和吸收、维生素消化和吸收等。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1为本专利技术的实施例1的七种样品的GC/MS总离子流色谱图(TIC)；从上到下依次为M-对照组、A-12h、B-24h、C-36h、D-48h、E-60h、N-VXP；图2为GC-MS谱PCA分析散点图；图3为B-24h、E-60h的OPLS-DA图；图4为B-24h、E-60h的S-plot图。具体实施方式实施例1：材料的准备：1)试验动物及添加剂：AA肉仔鸡购自吉林德详公司；酿酒酵母培养物由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供(发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h)；达农威益康VXP(达农威中国有限公司)。2)主要试剂：N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(BSTFA含1％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，使用气相色谱‑质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。

【技术特征摘要】
1.一种肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，使用气相色谱-质谱联用检测肉仔鸡采食不同发酵时间产出的酵母培养物后盲肠内容物的代谢物和代谢通路的变化，从而确定酵母培养物对肉仔鸡盲肠代谢调控及代谢产物的影响。2.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的气相色谱-质谱联用的检测条件为：气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱，柱温70℃，保留5min，以4℃/min升温至100℃，保持5min；以10℃/min升温至150℃，保持10min；以5℃/min升温至240℃，保持8min；以10℃/min升温至270℃，保持5min；载气为99.999％高纯He；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min；进样量1μL；分流比50：1，溶剂延迟时间3min；质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；接口温度280℃；质量范围20～800amu。3.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的不同发酵时间产出的酵母培养物是由吉林农业大学吉农博瑞研发中心提供的发酵时间分别为12h、24h、36h、48h、60h的五种酿酒酵母培养物和达农威中国有限公司提供的达农威益康VXP。4.根据权利要求1所述的肉仔鸡盲肠代谢物组的分析方法，其特征在于，所述的盲肠内容物在进入气相色谱-质谱联用仪之前需要前处理，处理的步骤为：称取冻干样品0.05g，将样品于1mLPE管中，分别加入100μL的20mg/mL甲氧胺盐酸吡啶溶液，混合时使用漩涡振荡器震荡30s，然后放于37℃水...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙喆，甄玉国，王涛，张学峰，赵巍，陈雪，赵小丽，郑艳秋，张玲玲，张维刚，谭胜男，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22