一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法。该方法从胀气浑浊烟用浆果类提取物中分离出污染微生物，经过涂片和1％蕃红染色后再进行显微镜观察，根据菌落形态和显微特征判断污染微生物种类；并在显微镜检的基础上，通过Biolog微生物自动分析系统鉴定污染微生物种名和属名；筛选适用于靶向微生物的抗菌剂，并采用96孔平板测定抗菌剂的最小抑菌浓度。选取对污染微生物有显著作用效果的抗菌剂，另外以未添加抗菌剂浆果类提取物作为对照，置于高温曝晒的环境下贮存6个月，贮存结束后观察发现，添加了抗菌剂的浆果类提取物未出现浑浊、胀气和气味的变化，测定活菌数明显降低，解决了浆果类提取物贮存周期短，产品质量不稳定的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法
本专利技术涉及烟用香原料的储存，具体是一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，通过该方法筛选出的抗菌剂添加到烟用浆果类提取物中，可以有利于延长烟用浆果类提取物的货架期和提高产品的质量稳定性，属于烟草

技术介绍
浆果，是一种多汁肉质单果，如葡萄、番茄、柿、蓝莓等。烟用浆果类提取物在卷烟应用中比较广泛，主要常见的是蔷薇科植物的果实。天然浆果类香料在卷烟中可以起到掩盖缺点、改善烟草香气和吃味、改进烟草的感官质量。一方面可以改善卷烟抽吸的口感(如焦味、苦涩等)，另一方面赋予卷烟独特的令人愉悦的果香香韵。烟用浆果类提取物一般采用蒸馏、萃取和压榨等提取工艺进行提取，由于其含糖成分较高，为微生物的生长提供了有利的营养条件，提取加工的产品容易受到微生物的污染。如采用压榨的樱桃提取物并未经过高温灭菌的处理，并且果皮中含有微生物，微生物引起的烟用浆果类提取物变质通常会出现浑浊、胀气和气味的变化。微生物对提取物的污染一方面缩短了提取物的储存周期，另一方面降低了提取物的感官评价质量。
技术实现思路
本专利技术目的是提供了一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，该方法筛选出的抗菌剂添加到烟用浆果类提取物中，可以抑制浆果类提取物的微生物生长，解决烟用浆果类提取物储藏周期短，产品质量不稳定的问题，并不会影响卷烟评价效果。本专利技术通过从污染提取物中分离得到微生物，经过显微检测鉴别微生物种类，采用微生物抑菌试验，筛选合适的食品级抗菌剂，根据对不同微生物的抑菌效果，将单一微生物抑菌效果显著的抗菌剂按照一定比例复配，制备一种具有显著抑制作用的抗菌剂，通过烟用浆果类提取物严酷存储环境验证，将筛选出来的抗菌剂添加到烟用浆果类提取物中，并将提取物置于高温曝晒的环境下贮存6个月，并未出现浑浊、胀气和气味的变化，且活菌数在100CFU/ml以下，延长了浆果类提取物的存储周期，解决了产品质量不稳定的问题，且不会影响该浆果类提取物在卷烟中的应用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进一步说明。但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，主要包括：污染微生物培养和分离鉴定—抗菌剂抑菌试验—严酷环境贮存验证。以下实施中的污染微生物培养和分离：称取1g烟用浆果类提取物污染样品加入99mL无菌生理盐水中，置于摇床上150r/min震荡10～15min,然后将悬浮液用无菌生理盐水稀释到10-7～10-5，并取出100μL均匀涂布在Waksman培养基上，将培养物放入30℃恒温培养箱内培养20～25h。以下实施例中的污染微生物鉴定：将培养好的污染微生物用接种环挑取单菌落，经过涂片和1％蕃红染色后再进行显微镜观察，根据菌落形态和显微特征判断污染微生物种类；并在显微镜检的基础上，采用灭菌棉签挑取已经培养好的污染微生物菌落，在无菌状态下接种到浊度管中，并用空白调至100％,用标准液管调到指定刻度，再用接种后的浊度管进行测量，用无菌水不断调整浊度的大小，达到以上标准浊度值，然后将制备好的菌悬液倒人加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于微平板的96孔中，微平板在28℃生化培养箱中，在培养第6h和第24h后，将微平板放入读数仪测定反应结果，从Microlog软件结果分析得出污染微生物的种名和属名。以下实施例中微生物抑菌试验：选用8种食品级抗菌剂(均为市售)，用灭菌吐温80溶液配制成体积分数为1％的母液，然后采用7次二倍稀释法，最终形成相当于母液浓度20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7的抗菌液浓度；用灭菌接种环挑取步骤(1)中培养好的污染微生物单个菌落，分别接种于Waksman液体培养基30℃恒温培养箱中培养2～4h，然后采用可见分光光度法测定菌悬液浓度，OD600nm在0.4～0.5时备用；用移液器在96孔板中分别加入0.9ml的Waksman液体培养基，按照不同梯度浓度分别加入0.1ml抗菌液，以加入0.1ml的吐温80溶液为阳性对照，混合均匀后接种20μL菌悬液，将孔板置于30℃，100rpm条件下培养24h，观察抑菌效果，选择出对每种污染微生物抑菌效果最显著的抗菌剂。(4)最低抑菌浓度的测定：把步骤(3)中抑菌试验中7个稀释浓度和对照进行编号，依次为X1、X2……X8，将样品摇匀后在吸收波长600nm处用可见分光光度计测定光密度值，当Xn-Xn-1/Xn取最大值时，Xn-1对应的浓度为该抑菌剂的最低抑菌浓度即该抗菌剂的最小添加量。以下实施例中的Waksman培养基配方(g/L)为：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，氯化钠5.0，牛肉膏3.0，琼脂18.0，pH6.8。实施例1提供的是一种延长樱桃提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其具体步骤如下：从胀气浑浊的樱桃提取物中分离微生物，采用细胞染色和Biolog微生物自动分析系统鉴定，分析得出樱桃提取物中污染微生物主要是酵母和芽胞杆菌类；并通过微生物抑菌试验筛选出2种对污染微生物有显著作用效果的抗菌剂，分别是乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠，相应的最低抗菌浓度分别为50ppm、10ppm。将两种微生物分别按照质量比为1:3、1:1和3:1的三个比例进行复配，并按照10～50ppm的用量添加到樱桃提取物中，另外以未添加抗菌剂樱桃提取物作为对照，将四个樱桃提取物置于高温曝晒的环境下贮存6个月。观察发现对照组樱桃提取物出现严重的浑浊、胀气和气味的变化，而3个处理组樱桃提取物其浑浊和胀气情况不明显，气味无变化，并且处理组中乳酸链球菌素和脱氢乙酸钠复配比例为3:1、用量为10～50ppm时效果最佳，活菌数在100CFU/ml以下，且按照正常香精香料添加的方式添加到卷烟中，经过评吸发现对卷烟评价效果无负面影响。实施例2中提供了一种延长杏子汁储藏货架期的抗菌剂筛选方法，其具体步骤如下：从浑浊、胀气的杏子汁中分离培养污染微生物，通过显微镜检和Biolog微生物自动分析系统(美国Biolog公司)鉴定污染微生物主要是酵母类；采用抑菌试验，筛选的最佳抗菌剂为脱氢乙酸钠；将脱氢乙酸钠用纯净水稀释到0.1％后，按照10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm的用量分别添加到杏子汁中，另外以未添加抗菌剂杏子汁作为对照，将样品置于高温曝晒的环境下贮存6个月，贮存结束后观察提取物是否出现浑浊、胀气和气味的变化，并采用稀释涂布平板计数法测定活菌数。试验结果表明，在脱氢乙酸钠用量为10ppm的情况下，杏子汁不出现浑浊和胀气，且活菌数为10～100CFU/ml，而对照样变浑浊、胀气明显，活菌数在107～108CFU/ml。实施例3中提供了一种延长葡萄提取物储藏货架期的抗菌剂筛选方法，其具体步骤如下：从浑浊、胀气的葡萄提取物中分离培养污染微生物，通过显微镜检和Biolog微生物自动分析系统(美国Biolog公司)鉴定污染微生物主要是酵母和产气杆菌类；采用抑菌试验，筛选的最佳抗菌剂为纳他霉素和乳酸链球菌素；选取乳酸链球菌素和纳他霉素两种显著效果的抗菌剂进行复配(比例为1:3，1:1和3:1)，按照50～100ppm的用量添加到葡萄提取物中，另外以未添加抗菌剂葡萄提取物作为对照，将样品置于高温曝晒的环境下贮存6个月，贮存结束后观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于具体包括以下步骤：(1)污染微生物培养和分离：称取1g烟用浆果类提取物污染样品加入99mL无菌生理盐水中，置于摇床上150r/min震荡10～15min,然后将悬浮液用无菌生理盐水稀释到10‑7～10‑5，并取出100μL均匀涂布在Waksman培养基上，将培养物放入30℃恒温培养箱内培养20～25h；(2)污染微生物鉴定：将步骤(1)中培养好的污染微生物用接种环挑取单菌落，经过涂片和1％蕃红染色后再进行显微镜观察，根据菌落形态和显微特征判断污染微生物种类；并在显微镜检的基础上，通过Biolog微生物自动分析系统鉴定污染微生物种名和属名；(3)抑菌试验：根据步骤(2)中判断的污染微生物种类，每个种类选用多种食品级抗菌剂，用灭菌吐温80溶液配制成体积分数为1％的母液，然后采用7次二倍稀释法形成不同梯度浓度的抗菌液；用灭菌接种环挑取步骤(1)中培养好的污染微生物单个菌落，分别接种于Waksman液体培养基30℃恒温培养箱中培养2～4h，然后采用可见分光光度法测定菌悬液浓度，OD600nm在0.4～0.5时备用；用移液器在96孔板中分别加入0.9ml的Waksman液体培养基，按照不同梯度浓度分别加入0.1ml抗菌液，以加入0.1ml的吐温80溶液为阳性对照，混合均匀后接种20μL菌悬液，将孔板置于30℃，100rpm条件下培养24h，观察抑菌效果，选择出对每种污染微生物抑菌效果最显著的抗菌剂；当步骤(2)中的测定的污染微生物种类为一种时，其选择出来的抗菌剂即为该烟用浆果类提取物的抗菌剂；当步骤(2)中测定的污染微生物种类等于或大于两种时，将两种或两种以上的抗菌剂进行复配得到该烟用浆果类提取物的抗菌剂；(4)最低抑菌浓度的测定：把步骤(3)中抑菌试验中7个稀释浓度和对照进行编号，依次为X1、X2……X8，将样品摇匀后在吸收波长600nm处用可见分光光度计测定光密度值，当Xn‑Xn‑1/Xn取最大值时，Xn‑1对应的浓度为该抑菌剂的最低抑菌浓度即该抗菌剂的最小添加量。...

【技术特征摘要】
1.一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于具体包括以下步骤：(1)污染微生物培养和分离：称取1g烟用浆果类提取物污染样品加入99mL无菌生理盐水中，置于摇床上150r/min震荡10～15min,然后将悬浮液用无菌生理盐水稀释到10-7～10-5，并取出100μL均匀涂布在Waksman培养基上，将培养物放入30℃恒温培养箱内培养20～25h；(2)污染微生物鉴定：将步骤(1)中培养好的污染微生物用接种环挑取单菌落，经过涂片和1％蕃红染色后再进行显微镜观察，根据菌落形态和显微特征判断污染微生物种类；并在显微镜检的基础上，通过Biolog微生物自动分析系统鉴定污染微生物种名和属名；(3)抑菌试验：根据步骤(2)中判断的污染微生物种类，每个种类选用多种食品级抗菌剂，用灭菌吐温80溶液配制成体积分数为1％的母液，然后采用7次二倍稀释法形成不同梯度浓度的抗菌液；用灭菌接种环挑取步骤(1)中培养好的污染微生物单个菌落，分别接种于Waksman液体培养基30℃恒温培养箱中培养2～4h，然后采用可见分光光度法测定菌悬液浓度，OD600nm在0.4～0.5时备用；用移液器在96孔板中分别加入0.9ml的Waksman液体培养基，按照不同梯度浓度分别加入0.1ml抗菌液，以加入0.1ml的吐温80溶液为阳性对照，混合均匀后接种20μL菌悬液，将孔板置于30℃，100rpm条件下培养24h，观察抑菌效果，选择出对每种污染微生物抑菌效果最显著的抗菌剂；当步骤(2)中的测定的污染微生物种类为一种时，其选择出来的抗菌剂即为该烟用浆果类提取物的抗菌剂；当步骤(2)中测定的污染微生物种类等于或大于两种时，将两种或两种以上的抗菌剂进行复配得到该烟用浆果类提取物的抗菌剂；(4)最低抑菌浓度的测定：把步骤(3)中抑菌试验中7个稀释浓度和对照进行编号，依次为X1、X2……X8，将样品摇匀后在吸收波长600nm处用可见分光光度计测定光密度值，当Xn-Xn-1/Xn取最大值时，Xn-1对应的浓度为该抑菌剂的最低抑菌浓度即该抗菌剂的最小添加量。2.根据权利要求1所述的一种延长烟用浆果类提取物货架期的抗菌剂筛选方法，其特征在于：所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭建，蹇顺华，李星，张敦铁，程书锋，
申请(专利权)人：湖北中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42