正十六烷基磷酸胆碱的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用技术

本发明专利技术公开了一种正十六烷基磷酸胆碱的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用。该正十六烷基磷酸胆碱的结构式如式I所示。本发明专利技术中的通过采用磷酸胆碱基团用十六烷基链进行疏水改性，制备细胞膜粘附分子正十六烷基胆碱磷酸盐，它可通过静电吸附和疏水相互作用粘附在细胞膜上，因此，可将正十六烷基胆碱磷酸盐作为疫苗免疫佐剂，其能够引发显着更高的抗原特异性体液和细胞免疫应答。本发明专利技术中制得的正十六烷基磷酸胆碱结合了磷酸胆碱CP和十六烷基链反应的优点，具有细胞黏附性，疏水性和生物安全性，可将其作为有效的疫苗递送系统，用于诱导有效的抗肿瘤免疫应答和抗癌症疾病。

【技术实现步骤摘要】
正十六烷基磷酸胆碱的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用
本专利技术属于生物医用材料领域，特别涉及一种正十六烷基磷酸胆碱的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用。
技术介绍
近几年，癌症免疫治疗作为一个新一代癌症治疗策略已经显示出巨大的潜力，并引起越来越多的关注。然而，如果单独使用肿瘤相关抗原，则不能诱导有效的免疫应答。因此，有效的肿瘤治疗需要免疫佐剂的帮助以引发强烈的抗肿瘤免疫应答。众所周知，免疫在预防严重传染疾病方面发挥了关键性的作用。此外，随着当前和新出现的严重传染性疾病，免疫接种将继续成为最重要的疾病预防工具。采用免疫接种进行疾病治疗已经取得了很好的成绩，如对一些白血病的成功免疫治疗。在免疫过程中，抗原递送是至关重要的一步。然而，抗原不能单独免疫，因为裸抗原不能在疾病预防和治疗过程中诱导有效的免疫应答。因此，在实践中不同种的抗原总是需要免疫佐剂的协助，以诱导强烈的抗肿瘤细胞免疫。同时，佐剂能够有助于诱导强烈的免疫应答同时具有生物安全性。迄今为止，在实践中广泛使用的免疫佐剂包括弗氏佐剂和铝佐剂，并且只有后者具有良好的生物安全性才得以被批准用于临床。几十年来，铝佐剂已经被用于捍卫人类免疫的许多传染性疾病。然而，用铝佐剂免疫仍不能诱导足够强的细胞免疫来对抗病毒性感染疾病和肿瘤等严重疾病。因此，迫切需要开发新型的免疫佐剂以帮助抗原引发有效的细胞免疫。近年来，已经进行了许多工作来开发新的免疫佐剂以辅助抗原递送。从广义上讲，这种免疫佐剂也可称为“疫苗递送系统”。针对整个抗原递送过程中的不同步骤设计和制备大量的新型疫苗递送系统。广泛采用的疫苗递送系统的设计策略包括抗原包封以防止过早降解，控制抗原释放，可持续抗原释放，靶向抗原递呈细胞(APCs)，用于细胞质递送的溶酶体逃逸以促进抗原交叉递呈然后引起细胞免疫等。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种正十六烷基磷酸胆碱。本专利技术的另一目的在于提供所述正十六烷基磷酸胆碱的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述正十六烷基磷酸胆碱作为疫苗免疫佐剂的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种正十六烷基磷酸胆碱，其结构式如式I所示：所述的正十六烷基磷酸胆碱的制备方法，包括如下步骤：(1)在保护性气体氛围下，将十六烷基二甲基叔胺和甲醇溶解到有机溶剂中，得到混合液Ⅰ；(2)将步骤(1)中得到的混合液Ⅰ降温至-90℃～0℃，然后逐滴加入2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷进行反应，待反应结束后恢复至室温，放置，过滤，取沉淀，得到沉淀物II；(3)将步骤(2)中得到的沉淀物II加热至25～90℃，搅拌反应，待反应结束后冷却至室温，洗涤，干燥，得到正十六烷基磷酸胆碱(C16-CP)。步骤(1)中所述的保护性气体优选为氮气。步骤(1)中所述的十六烷基二甲基叔胺和甲醇的摩尔比为1:10～10:1；优选为2:1。步骤(1)中所述的有机溶剂优选为三乙胺。步骤(1)中所述的有机溶剂的用量优选为每升有机溶剂配比0.12～3mol十六烷基二甲基叔胺计算。步骤(2)中所述的降温为采用干冰-丙酮浴进行降温；优选为采用干冰-丙酮浴降温至-78℃。步骤(2)中所述的2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷与所述十六烷基二甲基叔胺的摩尔比为1:5～5:1；优选为5：12。步骤(2)和(3)中所述的反应优选为在保护性气体氛围下进行反应；更优选为在氮气氛围下进行反应。步骤(2)中所述的反应的时间为1～10小时；优选为2小时。步骤(2)中所述的恢复至室温优选为采用加热的方式恢复至室温。步骤(2)中所述的放置的时间优选为1～10小时；优选为2小时。步骤(3)中所述的反应的温度优选为65℃。步骤(3)中所述的搅拌反应的时间为1～10小时(优选为搅拌过夜进行反应)。步骤(3)中所述的洗涤为采用四氢呋喃(THF)进行洗涤；优选为用四氢呋喃(THF)洗涤3次以上。所述的正十六烷基磷酸胆碱作为疫苗免疫佐剂的应用。所述的正十六烷基磷酸胆碱作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用。所述的正十六烷基磷酸胆碱作为疫苗免疫佐剂在免疫治疗中的应用。所述的免疫治疗包括癌症免疫治疗。一种疫苗制剂，包括所述的正十六烷基磷酸胆碱和抗原。所述的抗原优选为卵清蛋白。所述的疫苗制剂中正十六烷基磷酸胆碱和抗原的质量比为5:1～1:5；优选为3:1。所述的疫苗制剂的制备方法，包括如下步骤：将正十六烷基磷酸胆碱和抗原混合均匀后得到疫苗制剂。所述的疫苗制剂还包括佐剂。所述的佐剂优选为CpG寡聚脱氧核苷酸。所述的疫苗制剂中正十六烷基磷酸胆碱，抗原与佐剂的质量比为1～20：1～20：1～20；优选为1～10:1:0.4～1；更优选为3:1:0.4。所述的疫苗制剂的免疫接种方式优选为皮下注射。所述的疫苗制剂的制备方法，包括如下步骤：将正十六烷基磷酸胆碱，抗原和佐剂混合均匀后得到疫苗制剂。所述的正十六烷基磷酸胆碱在制备抗肿瘤药物中的应用。专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术提供了一种新型细胞膜粘附免疫佐剂，该新型细胞膜粘附免疫佐剂-正十六烷基磷酸胆碱通过采用磷酸胆碱基团用十六烷基链进行疏水改性，制备正十六烷基磷酸胆碱(C16-CP)作为疫苗递送系统，用于抗肿瘤免疫治疗。免疫结果表明，C16-CP纳米颗粒可以作为有效的疫苗递送系统，用于诱导有效的抗肿瘤免疫应答和抗癌症疾病。本研究提出的C16-CP递送的基于免疫的组合治疗方法可作为有效的疫苗递送系统，用于针对具有挑战性的癌症疾病进行有效的抗肿瘤免疫应答诱导。2、本专利技术制备的C16-CP在中性pH环境中带正电荷。因此细胞膜粘附分子C16-CP可以通过静电吸引和疏水相互作用粘附到细胞膜上。因此，阳离子脂质正十六烷基胆碱磷酸盐可通过静电吸引和疏水相互作用与OVA相互作用。3、本专利技术制备的C16-CP分子可通过静电吸引吸附电负性抗原或佐剂，并通过疏水相互作用吸附抗原分子的疏水结构域，形成带正电荷的纳米制剂。然后通过皮下注射进行免疫接种，从而进一步检测其免疫应答的效果。结果显示，可以引发显着更高的抗原特异性体液和细胞免疫应答。包括显著升高的抗原特异性IgG效价和细胞因子的分泌，且抑制了测试肿瘤模型中的E.G7-OVA生长并延长了小鼠的存活时间。因此，正十六烷基胆碱磷酸盐纳米颗粒可以作为有效的疫苗递送系统，用于诱导有效的抗肿瘤免疫应答和抗癌症疾病。4、本专利技术正十六烷基磷酸胆碱(C16-CP)结合了磷酸胆碱CP和十六烷基链反应的优点，是一种新型的生物医用高分子，具有细胞黏附性，疏水性，和生物安全性。附图说明图1是由本专利技术中制备的C16-CP(细胞膜粘附两亲性分子)和蛋白质分子OVA形成的C16-CP/OVA纳米颗粒的示意图，C16-CP的合成途径及其在D2O溶剂中的1HNMR和31PNMR中的谱图，C16-CP/OVA纳米颗粒的HRTEM图像，以及通过ImageJ1.47v测量的C16-CP/OVA纳米颗粒的相应直径分布直方图；其中，图a为C16-CP和蛋白质分子OVA形成的C16-CP/OVA纳米颗粒的示意图；图b为子C16-CP的合成途径；图c为C16-CP在D2O溶剂中的1HNMR和31PNMR中的谱图；图d为C16-CP/OVA纳米颗粒的HRTEM图像；图e为通过ImageJ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种正十六烷基磷酸胆碱，其特征在于，其结构式如式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种正十六烷基磷酸胆碱，其特征在于，其结构式如式I所示：2.权利要求1所述的正十六烷基磷酸胆碱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在保护性气体氛围下，将十六烷基二甲基叔胺和甲醇溶解到有机溶剂中，得到混合液Ⅰ；(2)将步骤(1)中得到的混合液Ⅰ降温至-90℃～0℃，然后逐滴加入2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷进行反应，待反应结束后恢复至室温，放置，过滤，取沉淀，得到沉淀物II；(3)将步骤(2)中得到的沉淀物II加热至25～90℃，搅拌反应，待反应结束后冷却至室温，洗涤，干燥，得到正十六烷基磷酸胆碱。3.根据权利要求2所述的正十六烷基磷酸胆碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的十六烷基二甲基叔胺和甲醇的摩尔比为1:10～10:1；步骤(2)中所述的2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧磷杂环戊烷与所述十六烷基二甲基叔胺的摩尔比为1:5～5:1。4.根据权利要求2所述的正十六烷基磷酸胆碱的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的保护性气体为氮气；步骤(1)中所述的有机溶剂为三乙胺；步骤(1)中所述的有机溶剂的用量为每升有机溶剂配比0.12～3mol十六烷基二甲基叔胺计算。步骤(2)中所述的降温为采...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗华，薛巍，袁洪媛，李莎，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44