一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶制造技术

本发明专利技术公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶及其应用。本发明专利技术通过蛋白质工程技术对野生型β‑葡萄糖苷酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种获得对胰蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶突变体。本发明专利技术所述的作用于纤维二糖和短链纤维寡糖的突变体β‑葡萄糖苷酶(mBGL1)，对胰蛋白酶的抗性比野生型BGL1提高2倍以上，半衰期延长，其他酶学性质与野生型酶基本一致。

A beta-glucosidase with increased resistance to trypsin

The present invention discloses a beta glucosidase with improved resistance to trypsin and its application. The invention modifies the key amino acid residues in the wild type beta glucosidase molecule by protein engineering technology, and provides a mutant of beta glucosidase with improved trypsinase resistance. The mutant beta glucosidase (mBGL1) acting on cellobiose and short-chain fibrooligosaccharide of the invention has a resistance to trypsin more than two times higher than that of wild-type BGL1, and a half-life longer. The other enzymatic properties are basically the same as those of wild-type enzymes.

【技术实现步骤摘要】
一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶
本专利技术涉及β-葡萄糖苷酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。
技术介绍
β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21，简称BGL1)又称为葡萄糖苷水解酶，它能水解纤维二糖和短链纤维寡糖生成葡萄糖，解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制，还可以把水果和茶叶中的香气前体物酶解，起到增强香气的作用。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，是纤维素酶系的重要组成成分之一。β-葡萄糖苷酶在人类的糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。近年来，其在食品工业中表现出了重要的应用前景：β-葡萄糖苷酶可水解果蔬中的风味前体物质如单帖烯醇糖苷等，释放出具有浓郁天然香气的物质，已成为食品工业中重要的风味增香剂。在制备功能性食品时则用于生物活性物质的转化，如豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接种产β-葡萄糖苷酶的微生物,都能够将豆奶及豆奶粉中生物有效性较低的异黄酮糖苷化合物高效转化为高活性的异黄酮苷元。β-葡萄糖苷酶的另一重要用途是作用于纤维素生物转化，纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义。在饲料工业中,β-葡萄糖苷酶常被作为一种饲料添加剂,它可以酶解富含纤维的细胞壁,使细胞内包含的蛋白质等营养物质释放出来,同时又将纤维降解为便于动物消化吸收的还原糖,从而提高饲料利用率。但是在实际应用中还是有许多不足,如稳定性不够好等，这会影响β-葡萄糖苷酶的有效性而增加了应用成本。因此对葡萄糖苷酶进行改造具有十分重要的意义。近十八年来，有关β-葡萄糖苷酶的专利有近190个，这些专利主要集中于发现和筛选来自不同来源的产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或通过基因重组方法获得产不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株(如所产β-葡萄糖苷酶具有嗜/耐热(ZL201610060528.7、ZL201310049606.X、ZL201510203453.9、ZL201510203484.4、ZL201110214130.1)、高温中性(ZL201410713835.1)、中温中性(ZL201410717927.7、ZL201110334815.X)、嗜热碱性(ZL200510116748.9)、嗜热耐酸性(ZL200910218167.4、ZL201410753327.6、ZL201510460386.9)、酸性(ZL201410718610.5)、嗜温耐乙醇(ZL201010577713.6、ZL201410235451.3)、高表达(ZL201010170523.2、ZL201410037538.X、ZL201410037437.2、ZL201010565278.5)、耐高糖(ZL201210540712.3、ZL201210541293.5、ZL201710698739.8、ZL201710366423.9、ZL201610095165.0、ZL201310224173.7、ZL201010248207.2)、耐糖耐酸(ZL201710839935.2)、高产耐糖耐酸(ZL201710839898.5)、耐高糖耐碱(ZL201410668699.9)、高产嗜温耐乙醇(ZL201110417104.9)、高活力(ZL201110102978.5)、高催化效率(ZL201610407183.8、ZL201610061066.0、ZL201610060603.X、ZL201610061593.1)、高耐受性(ZL201510175655.7)、持续高效分泌(ZL201310187648.X、ZL201510626711.4)等特征之一的菌株)，以及筛选产β-葡萄糖苷酶菌株的方法(ZL201510903621.5、ZL201210127162.2、ZL201710279045.0、ZL201410075528.5、ZL200710114837.9)，β-葡萄糖苷酶纯化方法(ZL200710043571.3)，β-葡萄糖苷酶酶活测定方法(ZL200910096109.9)，β-葡萄糖苷酶固定化方法(ZL201510920113.8、ZL201710579688.7、ZL201710689763.5、ZL201610348992.6、ZL201610899746.X、ZL201310712037.2、ZL201210449928.9、ZL201210052838.6、ZL201110293398.9、ZL200810035950.2、ZL201810109984.5)，β-葡萄糖苷酶制备方法(ZL201710581264.4、ZL201510026295.4、ZL201410510836.6、ZL201110374822.2、ZL200910153807.8、ZL200910092695.X、ZL201810034473.1)，构建产β-葡萄糖苷酶基因工程菌方法(ZL201410126924.6、ZL201410699758.9、ZL201610285023.0、ZL201610838951.5、ZL201510172770.9、ZL201510658194.9、ZL201410801030.2、ZL201410801031.7、ZL201210017857.5、ZL201110221185.5、ZL201110301931.1、ZL201110034926.9、ZL201110132525.7、ZL201110266535.X、ZL200910092527.0、ZL200610025503.X、ZL201110120297.1、ZL200910029055.4、ZL200910159235.4)，及上述所得β-葡萄糖苷酶的编码基因和应用等。通过检索中国学位论文库发现近年来有关β-葡萄糖苷酶酶活性质的论文有很多，其中主要集中于通过基因重组、复合诱变、改良筛选方法、对发酵条件进行优化等方法来提高其酶活以及热稳定性(Q55Q785、TQ925、TQ929.2、TQ925TQ920.1、Q939.9、TS261.11、TQ925、TS201.25TS201.3、Q814、Q814.1Q936)、葡萄糖耐受性(Q949.327.103、Q556.2Q786)催化效率提高(TQ925)、耐热、耐碱及耐部分金属离子的特点(Q93-331、S216.2、Q949.327.1Q943.2、TQ925.5、R282.71Q556.2)等等。而具有胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。本专利技术是对β-葡萄糖苷酶的基因(称为bgL1基因)进行定点突变。由绿色木霉(Trichodermaviride)中获得的β-葡萄糖苷酶，已经被测序，GENBANK登录号为FJ882071.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为ACS93768(SEQIDNO.1)。本专利技术基于酶促反应过渡以及计算生物学的方法筛选，获得了一株具有胰蛋白酶抗性提高的β-葡糖糖苷酶的突变体，其对胰蛋白酶的抗性比野生型BGL1提高2倍以上，其半衰期比野生型酶延长了50min，其他酶学性质与野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对胰蛋白酶抗性提高的β‑葡萄糖苷酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为ID NO.1的来源于绿色木霉(Trichoderma viride)的β‑葡萄糖苷酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第98、586和676位的取代。

【技术特征摘要】
1.一种对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：它是由氨基酸序列为IDNO.1的来源于绿色木霉(Trichodermaviride)的β-葡萄糖苷酶中制造多个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第98、586和676位的取代。2.根据权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所述在第98位的氨基酸取代是用谷氨酰胺取代精氨酸；在586位的氨基酸取代是用丝氨酸取代赖氨酸；在第676位的氨基酸取代是用脯氨酸取代精氨酸；所述的定点突变改造的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，林香娜，汪浩，谢春芳，刘大岭，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44