一种带鱼鱼肉降血压肽制造技术

本发明专利技术提供一种带鱼鱼肉降血压肽，氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，采用胰蛋白酶酶解和超滤的方式得到降血压肽粗品，再通过反向高效液相色谱柱层析纯化筛选得到一条降血压肽纯品。降血压肽段在体外显示出很强的血管紧张素转换酶抑制活性，在长期服用时能显著降低自发性高血压大鼠的血压。这种降血压肽段能够通过降低血液中Ⅱ型血管紧张素含量、抑制氧化应激反应及抗炎的多条降血压通路起到降血压目的。同时，该降血压肽在长期服用时对正常大鼠无毒性作用，不影响大鼠正常生长，对自发性高血压大鼠（SHR）体重无明显影响，对SHR心率无明显影响，是极具开发应用潜力的降血压活性物。

A Hypotensive Peptide from Hairpin Meat

The present invention provides an antihypertensive peptide of hairtail meat. The amino acid sequence is Ala Asn Ser Glu Val Ala Gln Trp Arg. The crude antihypertensive peptide is obtained by trypsinase hydrolysis and ultrafiltration, and a purified antihypertensive peptide is screened by reverse high performance liquid chromatography column chromatography. Antihypertensive peptide segment showed strong angiotensin converting enzyme inhibitory activity in vitro, which could significantly reduce blood pressure in spontaneously hypertensive rats after long-term administration. This antihypertensive peptide can reduce blood pressure by reducing the content of type II angiotensin, inhibiting oxidative stress and anti-inflammatory pathways. At the same time, the antihypertensive peptide has no toxic effect on normal rats, does not affect the normal growth of rats, has no significant effect on the body weight of spontaneously hypertensive rats (SHR), has no significant effect on the heart rate of SHR, and is a potential antihypertensive agent.

【技术实现步骤摘要】
一种带鱼鱼肉降血压肽
本专利技术属于生物活性肽
，具体涉及一种带鱼鱼肉降血压肽。
技术介绍
带鱼（Trichiuruslepturus），又叫刀鱼、裙带、肥带、油带、牙带鱼等，鲈形目，带鱼科，带鱼属。其体型侧扁如带，全身呈银色，在中国主要分布于黄海、东海、渤海以及南海，是中国四大经济鱼类之一。带鱼的鱼肉富含较高的蛋白质，有利活性肽的提取制备。近年来，许多研究者从不同的原料中分离纯化出多种活性肽。由于活性肽具有较高的特异性和效价，以及较低的毒性，在长期服用的治疗中极具潜力。降血压肽是活性肽中的一种，它能够降低高血压患者的血压，且对正常血压的人无影响。降血压肽通过抑制ACE酶的活性，减少Ⅱ型血管紧张素（AngⅡ）的生成，进而降低血压。有研究表明，除了肾素-血管紧张素系统，氧化应激以及炎症反应也能够引发高血压疾病。能够同时抑制ACE酶活性，减少氧化应激以及抗炎的降血压肽，降血压活性往往比单一通路降压的降血压肽要强。从带鱼鱼肉中分离纯化得到的降血压肽，能够通过多种降压途径有效降低血压，是效果显著的降血压物质。带鱼鱼肉降血压肽的出现，能给长期依赖降血压药的患者带去福音。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种带鱼鱼肉降血压肽，氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg（ANSEVAQWR），该肽段在体外实验均显示出较好的ACE抑制活性，动物实验显示其能够通过降低血液中的AngⅡ、抑制氧化应激以及抗炎进而降低大鼠的血压。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种带鱼鱼肉降血压肽，包括：选料、降血压肽酶解液的制备、降血压肽粗品的制备、降血压肽段组分的筛选、降血压肽的初次柱层析纯化以及降血压肽的柱层析二次纯化。具体步骤如下：（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉，烘干粉碎为带鱼鱼肉粉末。（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末与蒸馏水按1:10~1:20的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物带鱼鱼肉粉末质量比1:25~1:100加入胰蛋白酶，酶解pH为7~8，酶解时间为4~6h。酶解液即为降血压肽酶解液。（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为40~60r/min，超滤温度为4~8℃；超滤后将滤液浓缩冻干即为降血压肽粗品。（4）降血压肽段组分的筛选：将步骤（3）所得粗品与蒸馏水按照质量比为1:50~1:100与蒸馏水混匀，随后进行反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径30mm，柱长250mm，粒径10μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速15~25mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，将活性最高的组分收集。（5）降血压肽的初次柱层析纯化：将步骤（4）所收集的降血压肽组分滤出液进行反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径77mm，柱长450mm，粒径10μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速90~110mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集后准备下一轮纯化。（6）降血压肽的柱层析二次纯化：将步骤（5）所收集的降血压肽组分滤出液进行二次反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径4.6mm，柱长250mm，粒径5μm，上样体积为40~60μL；洗脱条件为：流动相：0~20min，10~40%乙腈，60~90%水；流速0.8~1.2mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集冻干后即为降血压肽纯品。本专利技术的优点在于：本专利技术提供的一种降血压肽，除了体外具有很强的ACE抑制活性外，还具有很强的体内降血压活性。该降血压肽段组分能通过降低血管内皮细胞的AngII含量、提升血管内皮细胞的抗氧化与抗炎能力的多通路达到降血压目的，降压活性强。附图说明图1为降血压肽段组分的筛选的色谱图。图2为降血压肽段初次柱层析纯化的色谱图。图3为降血压肽段二次柱层析纯化的色谱图。图4为降血压肽段纯品的一级和二级质谱图。图5为降血压肽段对自发性高血压大鼠的降压效应。图6为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞Ⅱ型血管紧张素（AngⅡ）浓度的影响。图7为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞超氧化物歧化酶（SOD）浓度的影响。图8为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞细胞粘附分子ICAM-1表达的影响。其中图A表示生理盐水处理组与A肽处理组的ICAM-1相较于β肌动蛋白的表达量，图B表示对应的免疫印迹电泳条带。具体实施方式以下是本专利技术的几个具体实施例，进一步说明本专利技术，但是本专利技术不仅限于此实施。胰蛋白酶（索莱宝生物科技有限公司），ACE活性抑制检测试剂盒（日本同仁化学研究所），超滤膜包（赛多利斯公司），C18色谱柱（10um30*250mm、10um77*450mm以及5um4.6*250mm，北京创新通恒科技有限公司），高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），离子井色谱质谱连用仪（赛默飞世尔科技公司），电泳仪（北京六一仪器厂），酶标仪（赛默飞世尔科技公司），12~13周的自发性高血压大鼠（北京维通利华实验动物有限公司），II型血管紧张素ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）测试试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔多抗VCAM-1（武汉三鹰生物技术有限公司）。实施例1一种降血压肽最优选制备方案，最终所得一种降血压肽段的序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，包括以下步骤：（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉作为降血压肽的提取原料。（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末按1:15的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物质量比1:50加入胰蛋白酶，酶解pH为8，酶解时间为5h。酶解液即为降血压肽酶解液。（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为50r/min，超滤温度为6℃；超滤后将滤液浓缩冻干即为降血压肽粗品。（4）降血压肽组分的筛选：将步骤（3）所得粗品按照质量比为1:100与蒸馏水混匀，随后反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径30mm，柱长250mm，粒径10μm，上样体积为50mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速20mL/min，柱温25℃，检测波长220nm，收集洗脱ACE抑制活性最强的组分，准备下一次纯化。如图1所示，带鱼鱼肉降血压粗肽初次过柱后有12个峰，其中4、7、8、9和11号峰是活性最高的主要的峰，而7号显示出的ACE抑制活性最强，其IC50（半抑制浓度）值为0.142。收集7号峰组分进行下一次柱层析纯化。（5）降血压肽的初次柱层析纯化：将步骤（4）所收集的1种降血压肽段滤出液进行反向高效液相色谱二次柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径77mm，柱长450mm，粒径10μm，上样体积为50mL；洗脱条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种带鱼鱼肉降血压肽，其特征在于：所述氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg。

【技术特征摘要】
1.一种带鱼鱼肉降血压肽，其特征在于：所述氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg。2.如权利要求1所述的一种带鱼鱼肉降血压肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：在带鱼鱼肉粉末加入蒸馏水，充分搅匀后加入胰蛋白酶酶解，酶解结束后抽滤、离心，收集上清液，得到降血压肽酶解液；将降血压肽酶解液经过10k、3kDa超滤膜超滤后收集滤液浓缩冻干，得到降血压肽粗品；将降血压肽粗品粉末与蒸馏水混合，经过一次反向高效液相色谱柱后收集出血管紧张素转换酶抑制活性最高的一个组分，随后该组分再经过2次反向高效液相色谱柱层析纯化后得到降血压肽纯品；每次柱层析后使用血管紧张素转换酶抑制活性试剂盒检测主要组分活性，收集最强活性的组分，冻干后进行下一次柱层析纯化。3.根据如权利要求2所述的一种带鱼鱼肉降血压肽的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉，烘干粉碎为带鱼鱼肉粉末；（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末按1:10~1:20的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物带鱼鱼肉粉末质量比1:25~1:100加入胰蛋白酶，酶解pH为7~8，酶解时间为4~6h；酶解液即为降血压肽酶解液；（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为40~60r/min，超滤温度为4~8℃；超滤后将滤液...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅维擎，张怡，郑宝东，胡嘉淼，曾红亮，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35