大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用技术

本发明专利技术公开了大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用，该eIF4EHOR3298包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列。dCAPS检测eIF4EHOR3298基因的技术方法和PCR引物分子，该引物分子包含：含有如SED ID NO.2所示的核苷酸序列的上游引物，及含有如SED ID NO.3所示的核苷酸序列的下游引物。本发明专利技术的抗性基因eIF4EHOR3298，对大麦黄花叶病毒和大麦温和花叶病毒的毒性株系具有抗性作用，可通过对抗性基因eIF4EHOR3298检测鉴定以获得抗性植株，可用于大麦黄花叶病抗性育种。本发明专利技术的dCAPS分子标记检测eIF4EHOR3298基因的技术方法，其能够有效检测该抗性基因eIF4EHOR3298，实现分子标记辅助育种。

Barley yellow mosaic disease resistance gene eIF4EHOR3298 and its identification method and Application

The invention discloses a barley yellow mosaic disease resistance gene eIF4EHOR3298 and its identification method and application. The eIF4EHOR3298 contains nucleotide sequences as shown in SED ID NO.1. The technical method of detecting eIF4EHOR3298 gene by dCAPS and the primer molecule of PCR include upstream primers containing nucleotide sequences as shown in SED ID NO.2 and downstream primers containing nucleotide sequences as shown in SED ID NO.3. The resistance gene eIF4EHOR3298 of the invention has resistance to barley yellow mosaic virus and barley mild mosaic virus toxic strains. The resistant plant can be obtained by detecting and identifying the resistance gene eIF4EHOR3298, and can be used for barley yellow mosaic disease resistance breeding. The dCAPS molecular marker detection method of eIF4EHOR3298 gene can effectively detect the resistance gene eIF4EHOR3298 and realize molecular marker assisted breeding.

【技术实现步骤摘要】
大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用
本专利技术涉及一种大麦黄花叶病抗性基因，具体涉及大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用。
技术介绍
大麦黄花叶病是一种土传病毒病害，由大麦黄花叶病毒(BaYMV)或大麦温和花叶病毒(BaMMV)或两者共存复合体引起，两种病毒均属于马铃薯Y病毒科，其是欧洲和东亚等冬大麦产区的重要病害之一，根据发病程度和发病时间不同，在感病田中大麦平均减产10％-50％，严重威胁欧亚地区冬大麦粮食生产。BaYMV和BaMMV寄生在土壤中的禾谷多黏菌的休眠孢子中，由于土壤耕种、风吹土壤颗粒、含有游动孢子的水分短距离运输，病毒随着真菌孢子的传播完成在不同植株和不同地域间传播。在自然条件下，BaYMV和BaMMV通常在秋季感染幼苗根部，来年早春最先在植株新叶中出现典型的花叶病症，随着病斑不断增多导致叶片黄化、植株矮小、分蘖少、籽粒产量下降，或早枯或不抽穗结实。由于禾谷多黏菌休眠孢子在土壤中能够存活10年以上，在外界环境适宜的情况下，携带病毒的休眠孢子萌发再次感染寄主植物，因而该病成为一种长期、持久的病害胁迫。大麦黄花叶病是我国长江中下游大麦产区最主要的病害，严重影响该地区的大麦产量。现有的化学和生物防治措施降低土壤中的禾谷多黏菌含量的效果有限，不能杜绝病害发生，农药的大量使用也会污染农田和环境。在自然条件下，部分大麦材料对大麦黄花叶病具有遗传抗病性，将抗病性基因导入栽培大麦品种中，可以有效防止病害发生，是当前农业生产中广泛采用的防控手段。由于自然选择条件下病毒频繁发生遗传变异，新毒性株系的出现可能导致当前的抗病性基因失效，鉴定新的抗性基因(或者已知基因新的抗性变异类型)因此具有重要的育种价值。目前，已知的大麦黄花叶病抗性位点共18个，只有2个基因PDIL5-1和eIF4E被图位克隆。抗性遗传位点rym4(rym，Resistancetoyellowmosaicdisease，抗黄花叶病)、rym5和rym6是等位基因，由真核生物翻译起始因子(eukaryotictranslationinitiationfactor4E)eIF4E序列突变导致，抗病材料中的eIF4E基因编码序列与感病材料不同，从而导致编码氨基酸序列改变；抗性遗传位点rym1和rym11是等位基因(rym为隐性基因)，由蛋白质二硫键异构酶基因(ProteinDisulfideIsomeraseLike)PDIL5-1功能丢失引起。rym4/rym5，rym1/11是大麦生产中主要使用的抗性资源。目前，德国、法国、日本等国家以及我国的长江中下游部分地区均出现了针对rym4、rym5、rym6和rym1/11的致病型毒性株系(例如欧洲毒性分离株BaYMV-II、BaMMV-SIL和BaMMV-Teil，日本毒性分离株BaYMV-III，我国的毒性分离株BaYMV-C和BaMMV-C)，意味着现有的抗性资源不能够满足育种使用，必须发掘新的抗性基因以及配套的分子标记选择方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用，解决了携带大麦黄花叶病抗性位点rym4/rym5和rym1/11出现致病型毒性株系的问题，携带抗性基因eIF4EHOR3298的大麦材料分别在多个病圃田(病圃携带的致病型毒性株系可以感染rym4/rym5和rym1/11)中展现出对大麦黄花叶病毒和大麦温性花叶病毒的完全抗性，可用于大麦黄花叶病抗性育种。为了达到上述目的，本专利技术提供了大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298，该eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种携带抗大麦黄花叶病基因的大麦，该大麦含有大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298，该eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298的鉴定方法，该方法包含：(1)将携带eIF4EHOR3298基因的大麦与携带PDIL5-1基因抗性变异基因rym1/11的大麦作为亲本材料进行杂交，获得F1代遗传材料，将F1代遗传材料自交获得F2代分离遗传群体；(2)将F2代及亲本材料随机播种于含有BaYMV/BaMMV病毒的病土中培育，待植株长大，进行表型调查，判断抗病或者感病；(3)提取植株的总RNA，反转录，采用PCR检测植株DNA中的PDIL5-1基因抗性变异基因rym1/11，对不携带rym1/11的植株进行遗传学分析和序列分析，从而获得eIF4EHOR3298基因，采用dCAPS分子标记技术检测eIF4EHOR3298基因。其中，所述eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。其中，所述dCAPS分子标记技术的引物分子包含：如SEDIDNO.2和SEDIDNO.3所示的核苷酸序列。优选地，在步骤(2)中，所述培育条件为：12℃光照和8℃黑暗交替。优选地，在步骤(3)中，所述总RNA是采用RNAzolreagent提取获得的。优选地，在步骤(3)中，所述反转录采用RTKitWithgDNAEraser。优选地，在步骤(3)中，所述rym1/11的遗传变异采用PCR检测，其反应体系为：体积比10：10：2：2：2：1：73的cDNAtemplate、10x含Mg2+的TaqBuffer、dNTPmix、上游引物PDI_45_743_f、下游引物PDI_45_743_r、5U/μLTaqDNApolymerase、ddH2O；其中，所述上游引物PDI_45_743_f包含：如SEDIDNO.4所示的核苷酸序列，所述下游引物PDI_45_743_r包含：如SEDIDNO.5所示的核苷酸序列。优选地，在步骤(3)中，所述eIF4EHOR3298基因dCAPS分子标记检测采用的反应分为两步：第一步反应是对eIF4E基因进行PCR扩增，采用的反应体系为：体积比10：10：2：2：2：1：73的DNAtemplate、10x含Mg2+的TaqBuffer、dNTPmix、上游引物dCAPS_HOR3298_f2、下游引物dCAPS_HOR3298_r、5U/μLTaqDNApolymerase、ddH2O；其中，所述上游引物dCAPS_HOR3298_f2包含：如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列，所述下游引物dCAPS_HOR3298_r包含：如SEDIDNO.3所示的核苷酸序列；第二步反应是对eIF4EHOR3298基因酶切，采用的反应体系为：体积比1000：200：5：795的PCR产物、10x的FlyCutBuffer、20U/μL的限制性内切酶EcoRI、ddH2O。本专利技术还提供了一种dCAPS分子标记检测eIF4EHOR3298基因的试剂盒，该试剂盒包含：引物分子含有如SEDIDNO.2所示的核苷酸序列的上游引物及含有如SEDIDNO.3所示的核苷酸序列的下游引物。本专利技术的大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298及其鉴定方法和应用，具有以下优点：本专利技术的抗性基因eIF4EHOR3298，对大麦黄花叶病毒和大麦温和花叶病毒的致病性毒性株系具有抗性作用，可用于大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298，其特征在于，该eIF4EHOR3298包含如SED ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298，其特征在于，该eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种携带抗大麦黄花叶病基因的大麦，其特征在于，该大麦含有大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298，该eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。3.一种大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298的鉴定方法，其特征在于，该方法包含：(1)将携带eIF4EHOR3298基因的大麦与携带PDIL5-1基因抗性变异基因rym1/11的大麦作为亲本材料进行杂交，获得F1代遗传材料，将F1代遗传材料自交获得F2代分离遗传群体；(2)将F2代及亲本材料随机播种于含有BaYMV/BaMMV病毒的病土中培育，待植株长大，进行表型调查，判断抗病或者感病；(3)提取植株的总RNA，反转录，采用PCR检测植株DNA中的PDIL5-1基因抗性变异基因rym1/11，对不携带rym1/11的植株进行遗传学分析和序列分析，从而获得eIF4EHOR3298基因，采用dCAPS分子标记技术检测eIF4EHOR3298基因；其中，所述eIF4EHOR3298包含如SEDIDNO.1所示的核苷酸序列。其中，所述dCAPS分子标记技术的引物分子包含：如SEDIDNO.2和SEDIDNO.3所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298的鉴定方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述培育条件为：12℃光照和8℃黑暗交替。5.根据权利要求3所述的大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298的鉴定方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述总RNA是采用RNAzolreagent提取获得的。6.根据权利要求3所述的大麦黄花叶病抗性基因eIF4EHOR3298的鉴定方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述反转录采用RTKitWithgDNAEraser。7.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨平，时丽洁，蒋枞璁，阚金红，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11