一种环状RNA及其在肝癌诊断中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种环状RNA，其具有如SEQ ID NO:1所示的序列，基于该环状RNA本发明专利技术还提供了一种核酸，其具有如SEQ ID NO:1所示的序列；或者，具有在如SEQ ID NO:1所示序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而产生的序列；或者，具有与前述两种序列互补或能结合的序列。该核酸为DNA或RNA，并且是单链的或双链的，并且是环状的或线性的。本发明专利技术还提供了所述环状RNA作为肝癌诊断标志物的应用，并进一步提供了基于前述核酸的肝癌诊断试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性，在肝癌早期即可提示诊断，且有可重复、易检测、侵入少的特点。

A Ring RNA and Its Application in the Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma

The invention discloses a cyclic RNA which has a sequence as shown in SEQ ID NO:1. Based on the cyclic RNA, the invention also provides a nucleic acid which has a sequence as shown in SEQ ID NO:1; or has a sequence generated by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides on the basis of the sequence as shown in SEQ ID NO:1; or has a sequence interacting with the two sequences mentioned above. A sequence that complements or binds. The nucleic acid is DNA or RNA, and it is single-stranded or double-stranded, and it is cyclic or linear. The invention also provides the application of the circular RNA as a diagnostic marker for hepatocellular carcinoma, and further provides a diagnostic kit for hepatocellular carcinoma based on the aforementioned nucleic acid. The kit has high specificity, can prompt diagnosis in the early stage of hepatocellular carcinoma, and has the characteristics of repeatability, easy detection and less invasion.

【技术实现步骤摘要】
一种环状RNA及其在肝癌诊断中的应用
本专利技术涉及一种肝癌诊断的标志物，尤其涉及一种新型circRNA肝癌标志物。
技术介绍
肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是严重威胁人类健康的世界性难题，居全球肿瘤发生的第五位，其病死率更是高居恶性肿瘤第二位。目前临床上通常按照“北卡罗来纳标准”，将肝癌治疗方式分成五种：手术根治性切除治疗，肝移植治疗，介入治疗，化疗和晚期病人的索拉菲尼(Sorafenib)治疗，但是肝癌高度的遗传异质性，且早期即可出现肝内播散及远处转移，患者术后复发风险极高，肝癌的治疗仍是一个棘手的难题。目前肝癌的诊断主要依靠影像学检测和血清标志物筛查。主要的血清标志物为甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3等。AFP是一种来自胚胎肝细胞的糖蛋白，胎儿出生约两周后，AFP从血清中消失。因此正常人血清中AFP浓度不到20μg/L。成人血清中AFP增高可能提示肝细胞肝癌或生殖腺肿瘤，一部分肝病活动期、妊娠阶段或消化道肿瘤也可导致AFP增高，但一般为低浓度。肝病活动期间，AFP常与ALT一同升高，但是多数情况下不超过400μg/L；如AFP与ALT反向活动或AFP持续升高，则高度提示肝癌。AFP目前仍是临床一线的肝癌血清学诊断标志物。然而AFP诊断肝癌的敏感性仅40％～65％，特异性在76～96％之间，当阴性结果出现时，往往疏忽HCC监测。理想的肝癌标志物需要有较高的敏感性，在肝癌早期即可提示诊断，且有可重复、易检测、侵入少的特点；同时还需要较高的特异性，能够将肝癌与肝炎、肝硬化、和其他消化道肿瘤区分开。因此还需进一步探索肝癌的血清学诊断标志物，从而减少肝癌的漏诊和误诊，提高肝癌的监测的准确性，从而改善肝癌患者整体预后。之前的研究表明，人类血清/血浆中稳定存在大量microRNA，为肝癌的非编码RNA诊断和预后奠定了理论基础。最新研究发现，在真核细胞转录组中含有大量的circRNA。由于特殊的环状闭合结构，circRNA较其他线性RNA分子更稳定，且具有细胞类型或发育阶段特定的表达模式。circRNA对核糖核酸酶不敏感(如RNaseR)，并且具有更长的半衰期，与此同时，与通蛋白质检测相比，通过定量实时PCR(qRT-PCR)和原位杂交检测circRNA更具敏感性和特异性。因此，circRNA是癌症体液诊断的潜在生物标志物。
技术实现思路
有鉴于现有技术存在的上述缺陷，本专利技术人在研究中发现了一种新型circRNA(hsa_circ_0027089)，并确定了其在肝癌患者的血浆中特异性存在，因此其可做为肝癌的诊断标志物。一方面，本专利技术提供的环状RNA(hsa_circ_0027089)具有如下序列：CTTAATTGGCTTAGTGTCGACTTCAATAATTGGAAAGACTGGGAAGATGATTCAGATGAAGACATGTCTAATTTTGATCGTTTCTCTGAGATGATGAACAACATGGGTGGTGATGAGGATGTAGATTTACCAGAAGTAGATGGAGCAGATGAT(SEQIDNO:1)。进一步，本专利技术提供了一种核酸，其具有以下a)或b)或c)：a)、如SEQIDNO:1所示的序列；b)、在a)序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而产生的序列；c)、与上述a)或b)序列互补或能结合的序列。进一步，上述核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链的或双链的，并且可以是环状的或线性的。进一步，本专利技术提供了上述核酸在肝癌诊断中的应用，所述环状RNA可以作为肝癌诊断标志物。另一方面，本专利技术提供了一种肝癌诊断试剂盒，该试剂盒中含有能够定量检测具有如SEQIDNO:1所示序列核酸的试剂。进一步，上述肝癌诊断试剂盒中含有能够定量检测具有以下a)或b)或c)的核酸的试剂：a)、如SEQIDNO:1所示的序列；b)、在a)序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而产生的序列；c)、与上述a)或b)序列互补或能结合的序列。优选地，所述肝癌诊断试剂盒采用定量实时PCR(qRT-PCR)或原位杂交的方法检测具有如前所述序列的核酸。优选地，所述肝癌诊断试剂盒的扩增引物序列为：5’-CAACATGGGTGGTGATGAGGAT-3’(SEQIDNO:2)5’-GAATCATCTTCCCAGTCTTTCCAA-3’(SEQIDNO:3)。所述肝癌诊断试剂盒的检测对象可以为医学上可用的各种体液或组织；优选地，所述肝癌诊断试剂盒的检测对象为血浆。进一步，本专利技术的研究还发现所述环状RNA(hsa_circ_0027089)在乙肝肝硬化、肝囊肿及肝血管瘤患者的血浆中没有显著升高，因此，所述环状RNA还可用于制备区分肝癌与乙肝肝硬化、肝囊肿及肝血管瘤的试剂盒。本专利技术所述肝癌诊断标志物及其诊断试剂盒具有以下有益技术效果：1、hsa_circ_0027089作为肝癌诊断标志物具有较高的敏感性，在肝癌早期即可提示诊断，且有可重复、易检测、侵入少的特点；2、hsa_circ_0027089作为肝癌诊断标志物还具有较高的特异性，能够将肝癌与肝炎、肝硬化和其他消化道肿瘤区分开；3、由于hsa_circ_0027089为环状闭合结构，它较其他线性RNA分子更稳定，并且具有更长的半衰期；4、本专利技术的肝癌诊断试剂盒采用定量实时PCR或原位杂交方法检测hsa_circ_0027089，比蛋白质检测具有更高的敏感性和特异性。附图说明图1为hsa_circ_0027089的Sangersequencing测序结果；图2为扩大样本量通过qPCR验证hsa_circ_0027089在肝癌患者血浆及其他样本中的相对表达量检测结果。具体实施方式以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果，但本专利技术并不受其限制。实施例本专利技术人在对肝癌病人血液研究的过程中，发现了一个高表达的环状RNA：hsa_circ_0027089，其序列是：CTTAATTGGCTTAGTGTCGACTTCAATAATTGGAAAGACTGGGAAGATGATTCAGATGAAGACATGTCTAATTTTGATCGTTTCTCTGAGATGATGAACAACATGGGTGGTGATGAGGATGTAGATTTACCAGAAGTAGATGGAGCAGATGAT(SEQIDNO:1)；hsa_circ_0027089的Sangersequencing测序结果如图1所示。本专利技术采用的具体研究方法如下：1、外周血标本的收集与处理标本收取于复旦大学附属中山医院，分别收取64例肝癌患者，40例乙肝肝硬化，40例肝囊肿及32例肝血管瘤患者血浆，每个标本收集0.5mL于冻存管中，放于-80度冰箱保存。所有研究对象均知情同意参加本项实验。并通过医院伦理委员会同意。2、样本制备与评估①RNA样品制备实验分为肝癌患者、乙肝肝硬化、肝囊肿及肝血管瘤患者。血浆样品总RNA抽提：血浆样品提取使用miRNeasySerum/Plasmakit(Qiagen)试剂盒。血浆提取：血浆样品于-80℃取出，室温解冻后，4℃12000g，10分钟高速离心，200μL血浆加1000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸，其特征在于，其具有以下a)或b)或c)：a)、如SEQ ID NO:1所示的序列；b)、在a)序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而产生的序列；c)、与上述a)或b)序列互补或能结合的序列。

【技术特征摘要】
1.一种核酸，其特征在于，其具有以下a)或b)或c)：a)、如SEQIDNO:1所示的序列；b)、在a)序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而产生的序列；c)、与上述a)或b)序列互补或能结合的序列。2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，其为DNA或RNA，并且是单链的或双链的，并且是环状的或线性的。3.一种环状RNA，其特征在于，其具有如SEQIDNO:1所示的序列。4.如权利要求3所述的环状RNA作为肝癌诊断标志物的应用。5.一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有能够定量检测如权利要求1所述核酸的试剂。6.一种肝癌诊断...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凯，战昊，胡捷，杨柳晓，孙绮蛮，周俭，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31