一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法技术

本发明专利技术公开一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，包括以下操作步骤：(1)收集藜芦未成熟蒴果，从果荚中拨出未成熟种子，进行灭菌处理；(2)在解剖镜下用解剖刀拨出种子内的幼胚，然后放入浸泡液中，浸泡处理30‑40min；(3)将经过步骤(2)处理过的幼胚加入到幼胚培养基中，24‑27℃暗培养；(4)等到幼胚长成4‑5cm小苗时，将小苗移到生根培养基中，待幼苗根系发育完好，移栽到草炭土中，其中生根培养基由MS培养基、60‑70mg/L铁盐、0.8‑1.2mg/L吲哚丁酸、2‑5mg/L透明质酸钠。本发明专利技术提供的一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，操作简单，法能将未成熟幼胚培养成苗，成活率高，其中幼胚的成活率平均值可以达到93％左右，小苗生根率平均值可以达到95％左右。

In Vitro Culture of Immature Embryos of Veratrum officinalis

The invention discloses a method for in vitro culture of immature embryos of medicinal plant Veratrum, which comprises the following operating steps: (1) collecting immature capsules of Veratrum, pulling immature seeds out of pods and sterilizing them; (2) pulling out immature embryos in seeds with an anatomical knife under an anatomical microscope, and then putting them into a soaking solution for 30 to 40 minutes; (3) adding the treated immature embryos to immature embryo culture; (2) adding the treated immature embryos to immature embryo culture. (4) When the immature embryos grow into 4 5 cm seedlings, the seedlings are transplanted into the rooting medium, and the rooting medium is MS medium, 60 70 mg/L iron salt, 0.8 1.2 mg/L indolebutyric acid, 2 5 mg/L sodium hyaluronate. The rooting medium is composed of MS medium, 60 70 mg/L iron salt, 0.8 1.2 mg/L indolebutyric acid and 2 5 mg/L sodium hyaluronate. The invention provides a method for in vitro culture of immature embryos of medicinal plant Veratrum verum, which is simple to operate and can cultivate immature embryos into seedlings with high survival rate, in which the average survival rate of immature embryos can reach about 93% and the average rooting rate of seedlings can reach about 95%.

【技术实现步骤摘要】
一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法
本专利技术属于生物育苗
，具体涉及一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法。
技术介绍
药用植物藜芦富含活性生物碱，在我国传统中药中主要用于治疗中风、痢疾、黄疸、头痛以及慢性疟疾等疾病，目前，已从藜芦中分离出100多种甾体生物碱。最新研究表明藜芦甾体生物碱环杷明及其衍生物能有效阻断癌症SonicHedgehog信号传导通道，对髓质母细胞瘤、基底细胞癌、小细胞肺癌具有明显的治疗作用，是有巨大市场潜力的抗癌药物。由于环杷明的化学结构复杂，近年来虽然环杷明和类环杷明半合成研究已取得一定进展，但人工最终合成环杷明仍然难度较大且成本较高。目前，这种次生代谢物只能从野生藜芦中提取。由于野生资源不足，药用成分含量低且不稳定，且因其生长有特殊的生境要求，人工栽培也较为困难，因此环杷明价格昂贵，不能满足市场需求。同时，对野生藜芦的长期过度开发和利用将会导致该野生资源的迅速枯竭。随着现代生物技术迅速发展，后基因组时代的到来，通过遗传工程很有希望克服这一困难。基因工程技术在提高药用有效成分含量和保护药用植物野生资源等方面能发挥重要的作用。野生藜芦幼胚培养能为科研工作者进行分子生物学研究或栽培技术研究提供研究材料，对利用遗传工程提高藜芦环杷明产量至关重要。目前虽然有利用藜芦成熟胚诱导胚性愈伤组织与绿苗再生的报导(Ma等2006)，其愈伤诱导培养基为MS附加4mg/Lpicloram，再生培养基为L2(无植物激素)，生根培养基为R2M(无植物激素)，但尚未有藜芦幼胚与幼苗培养的报导。利用常用植物幼胚离体起始培养基MS或MS附加0.1mg/L·6-BA和0.05mg/LNAA、生根培养基MS或1/2MS，由于黎芦幼胚分泌有毒酚类物质，幼胚难以培养成活。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，包括野生藜芦幼胚与幼苗培养方法以及培养基的制备方法，未成熟幼胚经过适宜的培养形成幼芽，幼芽经过进一步培养生根形成幼苗，为藜芦抗癌有效成分合成途径研究及人工栽培技术研究提供材料。本专利技术解决了藜芦未成熟幼胚培养中因分泌多酚等有毒化合物致使幼胚难以成活的问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的。一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，包括以下操作步骤：(1)收集藜芦未成熟蒴果，从果荚中拨出未成熟种子，进行灭菌处理；(2)在解剖镜下用解剖刀拨出种子内的幼胚，然后放入浸泡液中，浸泡处理30-40min，其中浸泡液由以下重量份的组分制成：2-5份1，2-环己二胺四乙酸、1-3份24-表油菜素内酯、7-10份盐酸甜菜碱、130-140份水；(3)将经过步骤(2)处理过的幼胚加入到幼胚培养基中，24-27℃暗培养，其中幼胚培养基由MS培养基、0.05-0.15mg/LNAA、4-6mg/L玉米素、0.3-0.6mg/L4-氯苯氧乙酸钠、0.4-0.8mg/L叶酸；(4)等到幼胚长成4-5cm小苗时，将小苗移到生根培养基中，待幼苗根系发育完好，移栽到草炭土中，其中生根培养基由MS培养基、60-70mg/L铁盐、0.8-1.2mg/L吲哚丁酸、2-5mg/L透明质酸钠。具体地，上述灭菌处理的步骤为：95％酒精灭菌1分钟，去掉酒精，加入0.5％HgCl2并搅动7分钟，倒掉HgCl2后用无菌水漂洗3次。具体地，上述步骤(2)中，幼胚的长度大于2mm。具体地，上述步骤(2)中，每克幼胚加入8-12ml的浸泡液。具体地，所述包括大量元素、微量元素、有机成分，大量元素：NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、CaCl2·2H2O440mg/L、MgSO1·7H2O370mg/L、KH2PO41700mg/L；微量元素：KI0.83mg/L、H3BO36.2mg/L、MnSO4·4H2O22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MnO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L+Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L；有机成分：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.5mg/L、甘氨酸2mg/L。由以上的技术方案可知，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，操作简单，法能将未成熟幼胚培养成苗，成活率高，其中幼胚的成活率平均值可以达到93％左右，小苗生根率平均值可以达到95％左右。步骤(2)中提供的浸泡液，可有效的增强幼胚的活性，使得幼胚可以从休眠的状态中快速的恢复活性，同时本专利技术提供的浸泡液，还能有效的抑制幼胚中发芽抑制剂的活性，进而有效的提升了幼胚的成活率；本专利技术通过在幼胚培养基中加入玉米素、4-氯苯氧乙酸钠、叶酸，有效的解决了藜芦未成熟幼胚培养中因分泌多酚等有毒化合物致使幼胚难以成活的问题；步骤(4)中的生根培养基，较常用生根培养基添加了额外的铁盐和IBA、透明质酸钠，藜芦幼芽能够正常生根且发育完好，而幼芽在常用生根培养基上却不能正常生根。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不能用来限制本专利技术的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验条件。实施例1一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，包括以下操作步骤：(1)尖被藜芦兴安藜芦开花期6月份，结果期7月份，尖被藜芦生长于吉林市北大壶海拔1200米高度阔叶下湿草地，兴安藜芦生长于桦甸市红石砬子镇王家店村原始森林下湿地，于7月30日采集未成熟藜芦蒴果，从果荚中拨出未成熟种子，进行灭菌处理；(2)在解剖镜下用解剖刀拨出种子内的幼胚，然后放入浸泡液中，浸泡处理30min，其中浸泡液由以下重量份的组分制成：2份1，2-环己二胺四乙酸、1份24-表油菜素内酯、7份盐酸甜菜碱、130份水；(3)将经过步骤(2)处理过的幼胚加入到幼胚培养基中，24℃暗培养，其中幼胚培养基由MS培养基、0.05mg/LNAA、4mg/L玉米素、0.3mg/L4-氯苯氧乙酸钠、0.4mg/L叶酸；(4)等到幼胚长成4cm小苗时，将小苗移到生根培养基中，待幼苗根系发育完好，移栽到草炭土中，其中生根培养基由MS培养基、60mg/L铁盐、0.8mg/L吲哚丁酸、2mg/L透明质酸钠。具体地，上述灭菌处理的步骤为：95％酒精灭菌1分钟，去掉酒精，加入0.5％HgCl2并搅动7分钟，倒掉HgCl2后用无菌水漂洗3次。具体地，上述步骤(2)中，幼胚的长度大于2mm。具体地，上述步骤(2)中，每克幼胚加入8ml的浸泡液。具体地，所述包括大量元素、微量元素、有机成分，大量元素：NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、CaCl2·2H2O440mg/L、MgSO4·7H2O370mg/L、KH2PO41700mg/L；微量元素：KI0.83mg/L、H1BO36.2mg/L、MnSO1·4H2O22.3mg/L、ZnSO4·7H2O8.6mg/L、Na2MnO1·2H2O0.25mg/L、CuSO1·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、FeSO4·7H2O27.8mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)收集藜芦未成熟蒴果，从果荚中拨出未成熟种子，进行灭菌处理；(2)在解剖镜下用解剖刀拨出种子内的幼胚，然后放入浸泡液中，浸泡处理30‑40min，其中浸泡液由以下重量份的组分制成：2‑5份1，2‑环己二胺四乙酸、1‑3份24‑表油菜素内酯、7‑10份盐酸甜菜碱、130‑140份水；(3)将经过步骤(2)处理过的幼胚加入到幼胚培养基中，24‑27℃暗培养，其中幼胚培养基由MS培养基、0.05‑0.15mg/L NAA、4‑6mg/L玉米素、0.3‑0.6mg/L 4‑氯苯氧乙酸钠、0.4‑0.8mg/L叶酸；(4)等到幼胚长成4‑5cm小苗时，将小苗移到生根培养基中，待幼苗根系发育完好，移栽到草炭土中，其中生根培养基由MS培养基、60‑70mg/L铁盐、0.8‑1.2mg/L吲哚丁酸、2‑5mg/L透明质酸钠。

【技术特征摘要】
1.一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)收集藜芦未成熟蒴果，从果荚中拨出未成熟种子，进行灭菌处理；(2)在解剖镜下用解剖刀拨出种子内的幼胚，然后放入浸泡液中，浸泡处理30-40min，其中浸泡液由以下重量份的组分制成：2-5份1，2-环己二胺四乙酸、1-3份24-表油菜素内酯、7-10份盐酸甜菜碱、130-140份水；(3)将经过步骤(2)处理过的幼胚加入到幼胚培养基中，24-27℃暗培养，其中幼胚培养基由MS培养基、0.05-0.15mg/LNAA、4-6mg/L玉米素、0.3-0.6mg/L4-氯苯氧乙酸钠、0.4-0.8mg/L叶酸；(4)等到幼胚长成4-5cm小苗时，将小苗移到生根培养基中，待幼苗根系发育完好，移栽到草炭土中，其中生根培养基由MS培养基、60-70mg/L铁盐、0.8-1.2mg/L吲哚丁酸、2-5mg/L透明质酸钠。2.如权利要求1所述的一种药用植物藜芦幼胚离体培养方法，其特征在于，上述灭菌处理的步骤为：95％酒精灭菌1分钟，去掉酒精，加入0.5％HgCl2并搅动7分钟，倒掉HgCl2后用无菌水漂...

【专利技术属性】
技术研发人员：马瑞，于志晶，尚丽霞，蔡勤安，王丹，任鹏飞，刘晓蕊，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22