用于DNA编码化合物库合成中酶链反应的T4 DNA连接酶缓冲液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了三种用于DNA编码化合物库构建中的T4 DNA连接酶缓冲液，1)无DTT的10X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是10～1000mM Tris‑HCl，10～500mM MgCl2，1～50mM ATP，pH 6.0～10.0；2)无Tris的2X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mM MgCl2，0.1～5.0mM ATP，1～20％的1,3‑丙二醇，0.1～5.0mM DTT，pH 6.0～10.0；3)无Tris，无DTT的2X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mM MgCl2，0.1～5.0mM ATP，1～20％的1,3‑丙二醇，pH 6.0～10.0。本发明专利技术还公开上述三种T4 DNA连接酶缓冲液的应用。本发明专利技术提供的缓冲液及其应用，克服了现有缓冲液酶链反应后残留成分对下一步化学反应带来不利影响的缺陷，缩短了DNA编码化合物库的合成周期。

T4 DNA Lipase Buffer for Enzyme Chain Reaction in DNA Coded Compound Library Synthesis and Its Application

The invention discloses three T4 DNA ligase buffers used in the construction of DNA coding compound libraries: 1) 10X T4 DNA ligase buffer without DTT, which is formulated as 10-1000 mM Tris_HCl, 10-500 mM MgCl2, 1-50 mM ATP, pH 6.0-10.0; 2) 2X T4 DNA ligase buffer without Tris, which is formulated as 1-200 mM sulfonic acid reagent, 1-400 mM Mg2, 0.1-5.0 mM ATP, 1. 3) No Tris, no DTT 2X T4 DNA ligase buffer. The formulation is 1-200 mM sulfonic acid reagent, 1-400 mM MgCl2, 0.1-5.0 mM ATP, 1-20% 1,3 propanediol, pH 6.0-10.0. 3) No Tris, no DTT 2X T4 DNA ligase buffer. The formulation is 1-200 mM sulfonic acid reagent, 1-400 mM MgCl2, 0.1-5.0 mM ATP, 1-20% 1,3 propanediol, pH 6.0-10.0. The invention also discloses the application of the three T4 DNA ligase buffers. The buffer solution provided by the invention and its application overcome the defect that the residual components of the existing buffer after enzyme chain reaction have adverse effects on the next chemical reaction, and shorten the synthesis cycle of the DNA coding compound library.

【技术实现步骤摘要】
用于DNA编码化合物库合成中酶链反应的T4DNA连接酶缓冲液及其应用
本专利技术属于生物化学领域，涉及3种用于DNA编码化合物库合成中酶链反应的T4DNA连接酶缓冲液的配制及其应用。
技术介绍
美国Scripps研究院的SydneyBrenner和RichardLerner教授于1992年提出了DNA编码化合物文库(DNAEncodedLibrary，简称DEL)的合成与筛选的概念(参考文献：Proc.Natl.Acad.Sci.,1992,89,5381，专利：US5573905)，该方法通过将一个有机小分子试剂与一段独特序列的DNA在分子水平进行连接(即对小分子试剂进行DNA标记)，利用组合化学的“组合-拆分”策略通过两个至多个循环快速地构建数量巨大的化合物库，该化合物库中每一个化合物都由不同有机小分子试剂残基组成，并由相应的唯一碱基序列的DNA标识，将极少量的DNA编码化合物库与靶标进行亲和筛选，与靶标没有吸附的化合物库分子先被洗掉，留下的与靶标有吸附的化合物库分子再洗脱下来，这时得到的化合物库分子浓度很低，常规手段难以分析和识别，但是通过DNA独有的聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)可以把得到的与靶标有吸附的化合物库分子中的DNA部分进行复制扩增直至得到的DNA量可以被DNA测序仪识别，测序后的数据再通过构建DNA编码化合物文库时创建的有机小分子试剂与每个具体DNA碱基序列之间的关系表来解码，进而找到可以识别具有潜在活性分子相对应的具体化合物对应的有机小分子试剂，我们再通过传统的有机合成方法把这些有机小分子试剂组合在一起得到筛选的目标分子，再检测并确认其对靶标的生理活性。DNA编码化合物库的构建方法主要有三种，第一种是以美国Ensemble公司为主利用DNA模板技术得到的DNA导向分子库(DNA-TemplatedChemicalLibrarySynthesis，简称DTCL)，第二种是以美国GSK公司，X-Chem公司和国内的成都先导公司为主利用DNA标记技术得到的DNA记录分子库(DNA-RecordedChemicalLibrary，简称DRCL)，第三种是以瑞士Philogen公司为主基于片段的药物设计(Fragment-baseddrugdiscovery，简称FBDD)技术得到的编码自组装分子库(EncodedSelf-AssemblingChemicalLibraries，简称ESAC)，目前工业上被大量运用的构建DNA编码化合物库的方法主要是第二种，该方法操作简单，成本更低，能更快速地利用组合化学方法得到含有海量的化合物的DNA编码化合物库。除了DNA起始片段(详见本公司专利技术专利申请号：201711263372.3，201711318894.9)外，需要有大量的DNA标签和可以按照一定顺序进行反应的有机小分子试剂。DNA标签的编码可以通过一定的计算机程序来获得，再通过DNA合成仪得到具体的DNA碱基序列的引物(详见本公司专利技术专利申请号：201711247220.4)；有机小分子试剂的获得，可以使用一定的计算机程序来对获得的试剂清单进行筛选得到自己想要的试剂(详见本公司专利技术专利申请号：201810378969.0)。不管采用的是单链还是双链技术，DNA编码化合物库的构建在短链DNA引物的链接上主要有两种方法，一是通过连接酶进行生化反应来进行链接，单链主要采用T4RNA连接酶和T4PNK磷酸化酶的方式链接两端都没有修饰的单链DNA引物，最早由YasunoriKinoshita和KoichiNishigaki于1995年报道(参考文献：NucleicAcidsSympSeries,1995,34,201-202)；双链主要采用T4DNA连接酶来链接带有粘末端，5'端是磷酸化修饰的双链DNA引物(参考文献：Nat.Chem.Biol.,2009,5,647-654，专利：EP2441757A1)。二是通过化学反应的方法来进行链接，SydneyBrenner和RichardLerner最早在报道DNA编码化合物库概念时，就使用的就是化学链接方法来链接单链DNA引物(参考文献：J.Am.Chem.Soc.,1993,115,9812-9813)，后来X-Chem公司发展和壮大了该方法(参考文献：Curr.Opin.Chem.Biol.,2015,26,80–88)，并成功用化学链接DNA引物的方法合成出一个多样性为3.34亿个分子的DNA编码化合物库(参考文献：Sci.Rep.,2015,5,10916)。本公司开发了双链DNA引物化学链接的方法(详见本公司专利技术专利公开号：CN108070009A)。由于化学链接需要很多两端经过特殊修饰的DNA引物，不但价格昂贵，储存困难，小分子端的化学反应对其引物端修饰物的稳定性也有待验证，反应的转化率也远远低于生物酶的连接效率，同时化学链接使用的化学反应还限制了其在小分子端的应用。因此，目前主流的链接DNA引物的方式还是使用T4DNA连接酶链接短链的双链DNA引物。但是市售的常规T4DNA连接酶，其连接酶缓冲液配方中的很多成分残留会对下一步化学反应产生严重影响，如一般T4DNA连接酶缓冲液中都含有DTT(二硫苏糖醇，CAS：3483-12-3)作为强还原剂对T4DNALigase蛋白进行抗氧化保护，在酶链这一步一旦有残留，对下一步化学反应是Pd催化的反应会带来严重影响，残留的硫醇会导致Pd中毒从而导致反应失败，且DTT的强还原作用，对于底物含有二硫键的化学试剂具有破坏作用。还有如一般T4DNA连接酶缓冲液中都含有Tris(三羟甲基氨基甲烷，CAS：77-86-1)提供酶连接反应的缓冲体系，在酶链这一步一旦有残留，对下一步化学反应DNA上的小分子端也是氨基的反应会形成竞争，导致需要消耗更多的小分子试剂，它们同时也会与参与反应的小分子胺形成竞争，导致短链DNA引物标签标记的小分子胺信息失真。目前国内外主要T4DNA连接酶供应商提供的10XT4DNA连接酶缓冲液的配方大同小异，主要的几个市售品牌的具体如下：Invitrogen货号EL0013的T4DNA连接酶的10XT4DNA连接酶缓冲液配方如下：400mMTris-HCl，100mMMgCl2，100mMDTT，5mMATP(pH7.8at25℃)。NewEnglandBioLabs货号B0202S的T4DNA连接酶的10XT4DNA连接酶缓冲液配方如下：500mMTris-HCl，100mMMgCl2，100mMDTT，10mMATP(pH7.5at25℃)。Enzymatics货号B6030的T4DNA连接酶的10XT4DNA连接酶缓冲液配方如下：500mMTris-HCl，100mMMgCl2，50mMDTT，10mMATP(pH7.6at25℃)。国内供应商南京诺唯赞生物科技有限公司货号N103-01的T4DNA连接酶的10XT4DNA连接酶缓冲液配方如下：500mMTris-HCl，100mMMgCl2，50mMDTT，10mMATP(pH7.6at25℃)。依科赛生物科技(太仓)有限公司货号MB000-5395的T4DNA连接酶的10XT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于DNA编码化合物库构建中的T4 DNA连接酶缓冲液，其特征在于，所述T4 DNA连接酶缓冲液为无DTT的10X T4 DNA连接酶缓冲液，其配方是10～1000mM Tris‑HCl，10～500mM MgCl2，1～50mM ATP，pH 6.0～10.0。

【技术特征摘要】
1.一种用于DNA编码化合物库构建中的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，所述T4DNA连接酶缓冲液为无DTT的10XT4DNA连接酶缓冲液，其配方是10～1000mMTris-HCl，10～500mMMgCl2，1～50mMATP，pH6.0～10.0。2.一种用于DNA编码化合物库构建中的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，所述T4DNA连接酶缓冲液为无Tris的2XT4DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mMMgCl2，0.1～5.0mMATP，1～20％的1,3-丙二醇，0.1～5.0mMDTT，pH6.0～10.0。3.一种用于DNA编码化合物库构建中的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，所述T4DNA连接酶缓冲液为无Tris，无DTT的2XT4DNA连接酶缓冲液，其配方是1～200mM磺酸类试剂，1～400mMMgCl2，0.1～5.0mMATP，1～20％的1,3-丙二醇，pH6.0～10.0。4.如权利要求1-3任一项所述的T4DNA连接酶缓冲液在DNA编码化合物库合成中的应用。5.如权利要求1所述的T4DNA连接酶缓冲液在DNA编码化合物库构建中用于下一步有Pd参与的反应的应用。6.如权利要求2所述的T4DNA连接酶缓冲液在DNA编码化合物库构建中用于下一步有小分子胺或可以与小分子胺反应的有机小分子试剂参与的有机反应的应用。7.如权利要求3所述的T4DNA连接酶缓冲液在DNA编码化合物库构建中用于下一步有小分子胺或可以与小分子胺反应的有机小分子参与的，且有Pd参与的金属反应的应用。8.如权利要求1所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，Tris-HCl的终浓度是10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，110mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，290mM，300mM，310mM，320mM，330mM，340mM，350mM，360mM，370mM，380mM，390mM，400mM，410mM，420mM，430mM，440mM，450mM，460mM，470mM，480mM，490mM，500mM，510mM，520mM，530mM，540mM，550mM，560mM，570mM，580mM，590mM，600mM，610mM，620mM，630mM，640mM，650mM，660mM，670mM，680mM，690mM，700mM，710mM，720mM，730mM，740mM，750mM，760mM，770mM，780mM，790mM，800mM，810mM，820mM，830mM，840mM，850mM，860mM，870mM，880mM，890mM，900mM，910mM，920mM，930mM，940mM，950mM，960mM，970mM，980mM，990mM，或1000mM。9.如权利要求1所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，MgCl2的终浓度是10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，110mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，290mM，300mM，310mM，320mM，330mM，340mM，350mM，360mM，370mM，380mM，390mM，400mM，410mM，420mM，430mM，440mM，450mM，460mM，470mM，480mM，490mM，或500mM。10.如权利要求1所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，ATP的终浓度是1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，11mM，12mM，13mM，14mM，15mM，16mM，17mM，18mM，19mM，20mM，21mM，22mM，23mM，24mM，25mM，26mM，27mM，28mM，29mM，30mM，31mM，32mM，33mM，34mM，35mM，36mM，37mM，38mM，39mM，40mM，41mM，42mM，43mM，44mM，45mM，46mM，47mM，48mM，49mM，或50mM。11.如权利要求1所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，pH值是6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，或10.0。12.如权利要求2或3所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，磺酸类试剂是4-羟乙基哌嗪乙磺酸，N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，2-(N-吗啉)乙磺酸，3-(N-玛琳代)丙磺酸，N-2-羟乙基哌嗪-N'-3-丙磺酸，或2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸钠。13.如权利要求2或3所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，磺酸类试剂的终浓度是1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，110mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，或200mM。14.如权利要求2或3所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，MgCl2的终浓度是1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM，20mM，30mM，40mM，50mM，60mM，70mM，80mM，90mM，100mM，110mM，120mM，130mM，140mM，150mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，290mM，300mM，310mM，320mM，330mM，340mM，350mM，360mM，370mM，380mM，390mM，或400mM。15.如权利要求2或3所述的T4DNA连接酶缓冲液，其特征在于，ATP终浓度是0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1.0mM，1.1mM，1.2mM，1.3mM，1....

【专利技术属性】
技术研发人员：吴阿亮，舒启胜，安玉龙，杨琪，袁堂蜜，龚平秀，袁友浪，张在红，李科，裴增飞，陈雯婷，蒯乐天，杨洪芳，彭宣嘉，
申请(专利权)人：上海药明康德新药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31