一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法，所述提取方法包括细胞裂解过程、DNA纯化过程、DNA回收过程和溶解DNA等过程。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术的裂解液可以充分、有效地裂解细胞，加快裂解进程，其在液态奶中提取核酸的方法，具有耗时短，步骤少，无裂解液浪费，提取的核酸质量比传统方法更纯，质量更高，提取的核酸的量比传统方法更大，适于对核酸质量要求高的实验，如16S rRNA测序和宏基因组测序等。

A Kind of Pyrolysis Solution and Its Method of Extracting Nucleic Acid from Liquid Milk

The invention relates to a lysate and a method for extracting nucleic acid from liquid milk. The extraction method includes cell lysis process, DNA purification process, DNA recovery process and DNA dissolution process. The pyrolysis solution of the present invention can fully and effectively crack cells and accelerate the pyrolysis process. The method for extracting nucleic acid from liquid milk has the advantages of short time-consuming, less steps and no waste of pyrolysis solution. The quality of the extracted nucleic acid is purer and higher than that of the traditional method, and the quantity of the extracted nucleic acid is larger than that of the traditional method. The method is suitable for experiments requiring high quality of nucleic acid. Such as 16S rRNA sequencing and macrogenome sequencing.

【技术实现步骤摘要】
一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法
本专利技术涉及一种裂解液，具体涉及一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法。
技术介绍
液态奶样品中微生物多样性分析日显重要，传统的分离培养技术，菌种形态检测技术等，一方面受到模拟培养环境上的挑战，另一方面受到了准确性及灵敏性的限制。随着高通量测序技术的发展及测序成本的大幅度降低，DNA水平上检测液态奶中微生物的组成，有着高灵敏度，较高准确度的优势。16SrRNA扩增子测序技术是研究环境中原核微生物多样性及群落组成差异的高通量测序技术之一，通过提取环境或者食品样品的DNA，选择合适的通用引物扩增16SrRNA的目标区域，通过检测目标区域的序列变异和丰度，来研究微生物多样性分布及数量差异分布。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种一种裂解液及其在液态奶中提取核酸的方法，其提取核酸的方法是提取液态奶中微生物总的DNA，具有耗时短，步骤少，无裂解液浪费，提取的DNA比传统方法杂质更少，质量更高，提取的DNA的量比传统方法更大等优点。本专利技术的目的是提供一种裂解液。本专利技术的另一目的是提供上述裂解液在液态奶中提取核酸的方法。根据本专利技术的具体实施方式的裂解液，所述裂解液为SDSLysisbuffer，所述SDSLysisbuffer由以下试剂配置而成，所述试剂包括：Tris-HCl、EDTA、SDS、Triton和NaCl。根据本专利技术的具体实施方式的裂解液所述SDSLysisbuffer由以下试剂配置而成，所述试剂包括：50mM的Tris-HClPH8.0，50mM的EDTA，1-4wt％的SDS，1wt％的Triton和250mM的NaCl。优选的，SDS的添加量为2wt％。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，所述提取方法包括以下步骤：(1)样品处理：室温均质牛奶样品，取1.0mL牛奶样品进行离心，弃掉上清液，得到沉淀物；(2)细胞裂解：在步骤(1)得到的所述沉淀物中加入800μLSDSLysisbuffer混匀，进行裂解，得到裂解液；(3)纯化DNA：在步骤(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上清液；(4)回收DNA：在步骤(3)得到的所述上清液中加入Glycogen、醋酸钠和异丙醇，混匀，-20℃孵育30min，离心弃掉上清液，并同时保留沉淀；(5)溶解DNA：在步骤(4)得到的所述沉淀中加入75％无水乙醇进行洗涤，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μLTEbuffer或者ddH2O，室温孵育8-10min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。其中，TEbuffer或者ddH2O为洗脱缓冲液。得到的检测样品也可以保存于-80℃的冰箱以便后续使用。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(1)中，将所述牛奶样品室温13000xg离心5min，沉淀样品，弃掉上清液，得到沉淀物。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(2)中，在所述沉淀物中加入500μLSDSLysisbuffer，上下吹打混匀，直至沉淀全部溶解，形成重悬浮液；再放入含有玻璃珠的离心管中振荡10min，得到第一次裂解液；然后向所述第一次裂解液中补加300μLSDSLysisBuffer混匀，得到所述裂解液。玻璃珠研磨是玻璃珠的随机碰撞，目的是物理性破坏菌体肽聚糖细胞壁，进一步降解细胞壁。加入玻璃珠后震荡10min，由于剧烈震荡造成试管内有较多气泡，为了避免补液时液体外溢造成交叉污染，可以室温条件下，13000xg离心3min，消除气泡的影响。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，进一步的，将所述重悬浮液转移到一个含有0.8-1g玻璃珠的1.5ml离心管中振荡10min，所述玻璃珠的直径为0.5mm，得到第一次裂解液；向所述第一次裂解液中补加300μLSDSLysisBuffer，65℃热孵育20min，期间上下颠倒使之混匀，得到所述裂解液。裂解液SDSLysisBuffer中SDS的浓度均为1-4％，优选2％。本专利技术的裂解液SDSLysisBuffer配方为50mMTris-HClPH8.0，50mMEDTA，1-4％SDS，1％Triton，250mMNaCl。混合了两种表面活性剂，一方面可以裂解细胞膜，一方面可以减少SDS-蛋白质-核酸的形成。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，进一步的，得到第一次裂解液后，将所述第一次裂解液13000xg离心3min，再向所述第一次裂解液中补加300μLSDSLysisBuffer。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(3)中，所述上清液中加入1倍体积的酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后在4℃下，16000xg离心10min，取上层清液。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(3)中，向步骤(2)得到的所述上清液中加入0.2倍体积的10M醋酸铵，冰上孵育5min，然后在25℃下，13000xg离心10min，取第二次上清液，加入1倍体积酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上清液。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(4)中，所述上清液中加入1μL的Glycogen、1/10体积的3M醋酸钠和1倍体积异丙醇，所述醋酸钠的pH为5.2，上下颠倒混匀5-6次，-20℃孵育30min，4℃，16000xg离心15min，弃掉上清液，并同时保持沉淀在离心管中。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，步骤(5)中，在所述沉淀中加入新鲜配制的75％无水乙醇洗涤两次，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μLTEbuffer或者ddH2O，室温孵育8min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。根据本专利技术的具体实施方式的所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其中，所述洗涤两次具体为：在所述沉淀中加入新鲜配制的75％无水乙醇，上下颠倒混匀使白色沉淀完全漂浮在洗液中，4℃，16000xg离心5min，弃掉上清液，再加入新鲜配制的75％无水乙醇重复洗涤一次，去掉上清液，保留沉淀。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术的裂解液可以充分、有效地裂解细胞，加快裂解进程；(2)本专利技术的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，提取的是液态奶中微生物总的DNA，耗时短：整个流程只需2小时；(3)步骤少：转移2-3次，只使用2-3次新离心管；(4)无裂解液浪费，裂解后，直接进行有机试剂抽提，减少DNA损失；(5)高质量提取：提取的DNA质量比传统方法更纯、质量更高，提取DNA的量比传统方法更大，适于对核酸质量要求高的实验，如16SrRNA测序和宏基因组测序等，可用于后续研究；(6)可重复性、易操作。附图说明图1显示不同提取方法得到的基因组DNA样品的1％琼脂糖凝胶电泳对比图；图2显示本专利技术的实施例3和实施例4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种裂解液，其特征在于，所述裂解液为SDS Lysis buffer，所述SDS Lysis buffer由以下试剂配置而成，所述试剂包括：Tris‑HCl、EDTA、SDS、Triton和NaCl。

【技术特征摘要】
1.一种裂解液，其特征在于，所述裂解液为SDSLysisbuffer，所述SDSLysisbuffer由以下试剂配置而成，所述试剂包括：Tris-HCl、EDTA、SDS、Triton和NaCl。2.一种如权利要求1所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：(1)样品处理：室温均质液态奶样品，取1.0mL液态奶样品进行离心，弃掉上清液，得到沉淀物；(2)细胞裂解：在步骤(1)得到的所述沉淀物中加入800μLSDSLysisbuffer混匀，进行裂解，得到裂解液；(3)纯化DNA：在步骤(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿进行抽提，旋涡振荡，直至白色悬浊液出现，室温孵育5min，然后离心取上层清液；(4)回收DNA：在步骤(3)得到的所述上层清液中加入Glycogen、醋酸钠和异丙醇，混匀，-20℃孵育30min，离心弃掉上清液，并同时保留沉淀；(5)溶解DNA：在步骤(4)得到的所述沉淀中加入75％无水乙醇进行洗涤，弃掉上清液，将沉淀室温晾干3-5min；加入20μLTEbuffer或者ddH2O，室温孵育8-10min后，轻弹混匀或者轻微涡旋混匀，即可获得检测样品。3.根据权利要求2所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，将所述液态奶样品室温13000xg离心5min，沉淀样品，弃掉上清液，得到沉淀物。4.根据权利要求2所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，在所述沉淀物中加入500μLSDSLysisbuffer，上下吹打混匀，直至沉淀全部溶解，形成重悬浮液；再放入含有玻璃珠的离心管中振荡10min，得到第一次裂解液；然后向所述第一次裂解液中补加300μLSDSLysisBuffer混匀，得到所述裂解液。5.根据权利要求4所述的裂解液在液态奶中提取核酸的方法，其特征在于，将所述重悬浮液转移到一个含有0.8-1g玻璃珠的1.5ml离心管中振...

【专利技术属性】
技术研发人员：李松励，李明，王加启，郑楠，赵圣国，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11