糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法技术

本发明专利技术涉及一种糖苷水解酶家族61蛋白基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；还涉及所述基因编码的蛋白，其蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的能表达糖苷水解酶家族61蛋白的基因序列，进一步利用pET26载体构建出重组质粒并转化到大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的可溶性表达，更提供的蛋白制备及其纯化的方法，可以得到浓度较高且纯度为95％以上的重组糖苷水解酶家族61蛋白，具有水解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的酶活性，属于糖苷水解酶家族61酶，可以按照不同应用将其和其他种类的纤维素酶进行搭配使用，以更优化的方式来使用，如和一种或多种β‑葡糖苷酶或纤维素内切酶联合使用。

Glycoside Hydrolase Family 61 Protein Gene and Its Protein and Preparation Method

The present invention relates to a glycoside hydrolase family 61 protein gene, the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No.1, and the protein encoded by the gene is also involved, and the amino acid sequence of the protein is shown as SEQ ID NO.2. The recombinant plasmid was constructed by using pET26 vector and transformed into E. coli expression strain. The soluble expression of the expressed product was realized. The preparation and purification method of the protein were also provided. The recombinant glycoside hydrolase family 61 protein with high concentration and purity of more than 95% could be obtained with water. Sodium carboxymethyl cellulose (CMC) produces glucose enzymes, belonging to the glycoside hydrolase family 61. It can be used in combination with other cellulase enzymes according to different applications, in a more optimized way, such as in combination with one or more beta-glucosidases or cellulose endonucleases.

【技术实现步骤摘要】
糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法
本专利技术属于生物基因工程
，涉及糖苷水解酶家族61蛋白基因及其蛋白和制备方法。
技术介绍
纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量最丰富的可再生性资源。目前，纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。随着石油和煤炭资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布最广、最丰富也最廉价的可再生性有机资源和多糖物质，是我国关注的重要研究领域。所以利用纤维素酶降解纤维素，使其转化成燃料、食物和化学制品，如糖，乙醇，饲料蛋白等，对缓解能源危机，食品和饲料资源紧张有重大的经济意义，纤维素酶将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等领域中发挥重要作用。目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制。其中纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇(由木质纤维素转化生成的燃料乙醇)工业化生产的主要瓶颈之一，也是备受关注的重要课题。除提高纤维素酶的本身活性外，一些具有促进纤维素酶活性的蛋白逐渐进入人们的视野，如GH61糖苷水解酶家族蛋白，GH61家族蛋白具有微弱的内切葡聚糖酶活性，所以起初一直被作为糖苷水解酶。后来发现GH61蛋白并不是传统意义上的糖苷水解酶，GH61蛋白的三维结构与糖苷水解酶有所不同，它在扩展的平面上有个重要的β折叠，中心包含一个被认为是与金属离子结合的N-末端的组氨酸。进一步的研究表明GH61家族蛋白属于氧化酶，可以通过氧化反应使得纤维素被部分氧化降解，并在一定程度上破坏其结晶结构，从而使纤维素更容易被纤维素酶降解。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种糖苷水解酶家族61蛋白基因。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1.糖苷水解酶家族61蛋白基因，所述糖苷水解酶家族61蛋白基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。核苷酸序列SEQIDNo.1由1524个脱氧核苷酸组成，本序列为成熟茯苓糖苷水解酶家族61蛋白(GH61)的全长cDNA读码框。本专利技术的目的在于还提供一种糖苷水解酶家族61蛋白基因编码的蛋白质。2.一种如SEQIDNo.1所示糖苷水解酶家族61蛋白基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，包含651个核苷酸残基。3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为SEQIDNo.1所示的糖苷水解酶家族61蛋白基因。进一步，所述空载体为pET26载体。4.一种重组菌，所述重组菌为包含目的基因如SEQIDNo.1所示的重组载体转化的重组菌。本专利技术的目的在于还提供一种糖苷水解酶家族61蛋白的制备方法。5.糖苷水解酶家族61蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)将权利要求1所述的基因重组到构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；2)将步骤1)表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的糖苷水解酶家族61蛋白。进一步，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含10-50mM咪唑的pH8.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mM咪唑的pH8.0缓冲液溶液将重组蛋白洗脱下来即可。进一步，洗脱液为含200mM咪唑的pH8.0缓冲液溶液。进一步，还可以将洗脱的蛋白液进行浓缩。进一步，浓缩的方法为将蛋白液在分子截留量为15kd的超滤浓缩管浓缩。进一步，浓缩的方法为将蛋白液在分子截留量为15kd的透析袋中用分子量大于10000的PEG包埋浓缩。进一步，浓缩的方法为将蛋白液进行冷冻干燥浓缩。6.糖苷水解酶家族61蛋白在制备葡萄糖中的应用。进一步，所述蛋白质将纤维素分解为葡萄糖的酶制剂中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术设计出一种新的能表达糖苷水解酶家族61蛋白的基因序列，进一步利用pET26载体构建出重组质粒并转化到大肠杆菌表达菌株，实现了表达产物的可溶性表达，得到大量可溶形式的重组糖苷水解酶家族61蛋白；由本专利技术提供的蛋白制备及其纯化的方法，可以得到浓度较高且纯度为95％的重组糖苷水解酶家族61蛋白，所制备出来的蛋白有水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)产生葡萄糖的酶活性，由本专利技术所制备的蛋白是单一的纤维素酶，属于糖苷水解酶家族61酶，可以按照不同应用将其和其他种类的纤维素酶进行搭配使用，以更优化的方式来使用，如和一种或多种β-葡糖苷酶或纤维素内切酶联合使用。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为本专利技术实施例中的pET26/GH61载体构建示意图。图2为本专利技术实施例中的含有pET26/GH61载体重组载体表达的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。图3为本专利技术实施例中的纯化前后重组糖苷水解酶家族61蛋白的SDS-PAGE检测结果图。图4为本专利技术实施例中的浓缩后的重组糖苷水解酶家族61蛋白的SDS-PAGE检测结果图。图5为本专利技术对比例中样品的SDS-PAGE检测结果图。图6为本专利技术实施例中重组蛋白酶活性检测的HPLC结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。本专利技术选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET26均购自美国Invritrogen公司。所用培养基配方和试剂配方如下：1)LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；2)LB/Amp平板：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的卡那霉素(Kan)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.糖苷水解酶家族61蛋白基因，其特征在于：所述糖苷水解酶家族61蛋白基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.糖苷水解酶家族61蛋白基因，其特征在于：所述糖苷水解酶家族61蛋白基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种如权利要求1所述的糖苷水解酶家族61蛋白基因编码的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的糖苷水解酶家族61蛋白基因。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET26载体。5.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌为权利要求3所述的载体转化的重组菌。6.根据权利要求2所述蛋白质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将权利要求1所述的基因重组到构建到载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；2)将步...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兴，王晓红，岳芬芳，李洪波，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43