一种构树叶片蛋白质分离方法技术

本发明专利技术公开了构树叶片蛋白质分离方法。本发明专利技术所提供的方法可用于分离所有植物叶片蛋白质，具体是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离，包括如下步骤：a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；b)待第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；c)将平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；d)待第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离。使用本发明专利技术所述方法分离植物叶片蛋白，有利于了解植物光合作用的重要部位——叶片，为运用生物技术手段进一步改良品种，提高植物品质打下基础。

A Method for Protein Separation from Broussonetia papyrifera Leaves

The invention discloses a method for separating protein from leaf of Broussonetia papyrifera. The method provided by the present invention can be used to separate all plant leaf proteins, specifically using protein bidirectional polyacrylamide gel electrophoresis to separate plant leaf proteins, including the following steps: a) carry out first isoelectric focusing electrophoresis on the leaf protein samples of the plants to be separated; b) remove the adhesive strip after the first isoelectric focusing electrophoresis is finished, and glue strip balance; and C). The second SDS polyacrylamide gel electrophoresis (d) was applied to the balanced strips, and the gel was removed after second to SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Coomassie brilliant blue staining was performed. The results were scanned and analyzed by image analysis to complete the separation of protein from plant leaves. The method of separating plant leaf protein by the present invention is beneficial to understand the leaf, which is an important part of plant photosynthesis, and lays a foundation for further improving varieties and improving plant quality by means of biotechnology.

【技术实现步骤摘要】
一种构树叶片蛋白质分离方法
本专利技术属于蛋白质分离检测领域，涉及一种构树叶片蛋白质分离方法。
技术介绍
构树是一种多功能综合性树种，整个植株都具有开发潜力。其叶片含有丰富的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等营养成分，可以部分替代豆粕、麦麸等常规饲料，用于猪、牛、羊等家畜养殖。在我国饲料行业的配方技术结构仍以玉米-豆粕型为主。豆粕、玉米等大宗原料对外依存度越来越高，受国际市场影响愈来愈大。因此，如何突破现有的配方技术，开发新的原料和替代品，成为增强企业综合实力，提高竞争力的重要挑战。构树叶片正是解决这一问题的关键。2015年构树扶贫已列为国务院十大精准扶贫项目之一。叶片是植物光合作用的重要场所，也是构树作为饲料的主要部位。双向凝胶电泳技术(2-DE)作为研究植物蛋白质组的重要手段，在分离叶片蛋白质中，往往出现RuBisCO超高丰度蛋白干扰导致横向或纵向拖尾等现象，严重影响2-DE的分辨率以及检测结果的可靠性。因此，优良的2-DE分离方法可以为生物技术手段进行品种改良提供准确、可靠理论依据。而现有技术中关于构树叶片蛋白质分离的方法存在分离效果差，分离效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物叶片蛋白质的分离方法。本专利技术所提供的植物叶片蛋白质的分离方法，是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离。所述方法包括如下步骤：(a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；(b)待步骤(a)的第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；(c)将经步骤(b)平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；(d)待步骤(c)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离。在所述方法的步骤(a)中，所述待分离的植物叶片蛋白质样品为采用TCA/丙酮沉淀法获得的来自于所述待分离的植物叶片的蛋白质干粉。进一步，所述待分离的植物叶片蛋白质样品按照包括如下步骤的方法制备获得：将所述待分离的植物叶片加入到匀浆缓冲液中，冰上研磨成匀浆；将所得匀浆收集到离心管中，离心(如8000-12000g4℃离心8-12min；更加具体的如10000g4℃离心10min)取上清，加入4倍体积的50％TCA(浓度为500g/L的三氯乙酸水溶液)，混匀，冰上静置沉淀40-60min(如50min)，离心(如15000-25000g4℃离心8-12min；更加具体的如20000g4℃离心10min)弃上清，将沉淀用预冷(4℃)的丙酮(含10g/LDTT)清洗3-5次(如4次)，真空干燥，所得蛋白干粉即为所述待分离的植物叶片蛋白质样品。其中，所述待分离的植物叶片和所述匀浆缓冲液的使用配比为：200-400mg：1.2-2.4mL(具体如300mg：1.8mL)。其中，所述匀浆缓冲液的溶剂为去离子水，溶质及浓度可如下：15-25mMTris-HCl、200-300mM蔗糖、8-12mMEGTA、0.8-1.2mMPMSF、3-7％(体积百分含量)β-巯基乙醇、0.8-1.2％(体积百分含量)TritonX-100；pH＝7.5。更加具体的，在本专利技术中，所述匀浆缓冲液的溶剂为去离子水，溶质及浓度具体如下：20mMTris-HCl、250mM蔗糖、10mMEGTA、1mMPMSF、5％(体积百分含量)β-巯基乙醇、1％(体积百分含量)TritonX-100；pH＝7.5。在所述方法的步骤(a)中，进行所述第一向等电聚焦电泳的方法可包括如下步骤：(a1)将pH4-7且长度9-12cm的IPG预制胶条浸泡在180-250微升含有0.5-1.0毫克所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中，12小时后取出所述IPG预制胶条；(a2)将经过步骤(a1)处理的所述IPG预制胶条按照如下条件进行等电聚焦电泳：20℃恒温，按顺序在300V、600V和1000V电压下分别电泳0.6-1.5小时，然后在30-90分钟内线性升压至8000V，再在8000V电压下电泳4-6小时。更进一步，进行所述第一向等电聚焦电泳的方法具体包括如下步骤：(a1)将pH4-7且长度11cm的IPG预制胶条浸泡在200微升含有0.5-1.0毫克所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中，12小时后取出所述IPG预制胶条；(a2)将经过步骤(a1)处理的所述IPG预制胶条按照如下条件进行等电聚焦电泳：20℃恒温，按顺序在300V、600V和1000V电压下分别电泳1小时，然后在60分钟内线性升压至8000V，再在8000V电压下电泳5小时。在本专利技术中，含有所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中除了所述待分离的植物叶片蛋白质样品外，其余为如下溶液：7M尿素、2M硫脲、质量百分含量4％CHAPS、质量百分含量2％PharmalytepH3-10、质量百分含量1％DTT，余量为水(去离子水)。所述IPG预制胶条具体为“AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden”产品；进行所述等电聚焦电泳时采用的电泳仪为ultiphorIIelectrophoresisunit(“AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden”产品)。在本专利技术中，所述植物具体为构树。在所述方法的步骤(b)中，进行所述胶条平衡的方法具体可包括如下步骤：(b1)将所述胶条(即进行过所述第一向等电聚焦电泳后的所述IPG预制胶条)在pH8.6的平衡缓冲液A中平衡15分钟后取出所述胶条；(b2)将经过步骤(b1)处理的所述胶条转入pH8.6的平衡缓冲液B中平衡15分钟；所述pH8.6的平衡缓冲液A的溶剂为水，溶质及浓度如下：8-12g/L二硫苏糖醇(DDT)、5-7M尿素、250-350g/L甘油、15-25g/L十二烷基硫酸钠(SDS)、40-60mMTris-HCl；所述pH8.6的平衡缓冲液B的溶剂为水，溶质及浓度如下：20-30g/L碘乙酰胺、8-12g/L二硫苏糖醇(DDT)、5-7M尿素、250-350g/L甘油、15-25g/L十二烷基硫酸钠(SDS)、40-60mMTris-HCl。更加具体的，在本专利技术中，所述pH8.6的平衡缓冲液A的溶剂为水，溶质及浓度具体如下：10g/L二硫苏糖醇(DDT)、6.0M尿素、300g/L甘油、20g/L十二烷基硫酸钠(SDS)、50mMTris-HCl。所述pH8.6的平衡缓冲液B的溶剂为水，溶质及浓度具体如下：25g/L碘乙酰胺、10g/L二硫苏糖醇(DDT)、6.0M尿素、300g/L甘油、20g/L十二烷基硫酸钠(SDS)、50mMTris-HCl。在所述方法的步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，采用的浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量可为3％-6％，采用的分离胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量可为10％-20％。更进一步，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，采用的浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量具体为4％，采用的分离胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量具体为15％。在所述方法的步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，可按照包括如下步骤的方法制备电泳胶：先在灌胶模具中灌入所述分离胶，静置直至所述分离胶凝固，接着灌入所述浓缩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物叶片蛋白质的分离方法，是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；(b)待步骤(a)的第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；(c)将经步骤(b)平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；(d)待步骤(c)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离；步骤(a)中，所述待分离的植物叶片蛋白质样品为采用TCA/丙酮沉淀法获得的来自于所述待分离的植物叶片的蛋白质干粉；步骤(a)中，进行所述第一向等电聚焦电泳的方法包括如下步骤：(a1)将pH4‑7且长度9‑12cm的IPG预制胶条浸泡在180‑250微升含有0.5‑1.0毫克所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中，12小时后取出所述IPG预制胶条；(a2)将经过步骤(a1)处理的所述IPG预制胶条按照如下条件进行等电聚焦电泳：20℃恒温，按顺序在300V、600V和1000V电压下分别电泳0.6‑1.5小时，然后在30‑90分钟内线性升压至8000V，再在8000V电压下电泳4‑6小时；步骤(b)中，进行所述胶条平衡的方法包括如下步骤：(b1)将所述胶条在pH8.6的平衡缓冲液A中平衡15分钟后取出所述胶条；(b2)将经过步骤(b1)处理的所述胶条转入pH8.6的平衡缓冲液B中平衡15分钟；所述pH8.6的平衡缓冲液A的溶剂为水，溶质及浓度如下：8‑12g/L二硫苏糖醇、5‑7M尿素、250‑350g/L甘油、15‑25g/L十二烷基硫酸钠、40‑60mM Tris‑HCl；所述pH8.6的平衡缓冲液B的溶剂为水，溶质及浓度如下：20‑30g/L碘乙酰胺、8‑12g/L二硫苏糖醇、5‑7M尿素、250‑350g/L甘油、15‑25g/L十二烷基硫酸钠、40‑60mM Tris‑HCl；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，采用的浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为3％‑6％，采用的分离胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为10％‑20％；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，按照包括如下步骤的方法制备电泳胶：先在灌胶模具中灌入所述分离胶，静置直至所述分离胶凝固，接着灌入所述浓缩胶，得到垂直胶板，位于所述垂直胶板上部的所述浓缩胶的高度为1‑3cm，位于所述垂直胶板下部的所述分离胶的高度10‑15cm；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法包括如下步骤：将经步骤(b)平衡后的胶条放在所述电泳胶的顶端，用质量百分含量为0.8‑1.2％的琼脂糖溶液密封后置于电泳槽上，在电泳槽中加满电极缓冲液后，先在电流为3mA‑5mA的条件下预电泳15‑35分钟，然后在电流为30mA的条件下电泳2.5‑4小时，完成所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中，所述电极缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：质量百分含量为0.2％‑0.5％的Tris、质量百分含量为1.0％‑1.6％的甘氨酸、质量百分含量为0.05％‑0.15％的SDS；所述植物为构树。...

【技术特征摘要】
1.一种植物叶片蛋白质的分离方法，是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；(b)待步骤(a)的第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；(c)将经步骤(b)平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；(d)待步骤(c)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离；步骤(a)中，所述待分离的植物叶片蛋白质样品为采用TCA/丙酮沉淀法获得的来自于所述待分离的植物叶片的蛋白质干粉；步骤(a)中，进行所述第一向等电聚焦电泳的方法包括如下步骤：(a1)将pH4-7且长度9-12cm的IPG预制胶条浸泡在180-250微升含有0.5-1.0毫克所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中，12小时后取出所述IPG预制胶条；(a2)将经过步骤(a1)处理的所述IPG预制胶条按照如下条件进行等电聚焦电泳：20℃恒温，按顺序在300V、600V和1000V电压下分别电泳0.6-1.5小时，然后在30-90分钟内线性升压至8000V，再在8000V电压下电泳4-6小时；步骤(b)中，进行所述胶条平衡的方法包括如下步骤：(b1)将所述胶条在pH8.6的平衡缓冲液A中平衡15分钟后取出所述胶条；(b2)将经过步骤(b1)处理的所述胶条转入pH8.6的平衡缓冲液B中平衡15分钟；所述pH8.6的平衡缓冲液A的溶剂为水，溶质及浓度如下：8-12g/L二硫苏糖醇、5-7M尿素、250-350g/L甘油、15-25g/L十二烷基硫酸钠、40-60mMTris-HCl；所述pH8.6的平衡缓冲液B的溶剂为水，溶质及浓度如下：20-30g/L碘乙酰胺、8-12g/L二硫苏糖醇、5-7M尿素、250-350g/L甘油、15-25g/L十二烷基硫酸钠、40-60mMTris-HCl；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，采用的浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为3％-6％，采用的分离胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为10％-20％；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，按照包括如下步骤的方法制备电泳胶：先在灌...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈世华，王小曼，邳植，彭献军，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11