经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法制造技术

本公开总体上涉及经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法，其特别可与质谱联用。所述方法包括向携带样品的流动相中加入添加剂。流动相添加剂可有效改善所获得数据中靶标分析物的峰形，并/或消除或至少减少离子抑制。所述方法特别适合阴离子化合物，例如磷酸化化合物。

Improved liquid chromatography for anionic compounds

The present disclosure relates generally to an improved liquid chromatography method for anionic compounds, in particular to mass spectrometry. The method includes adding additives to the mobile phase carrying the sample. Mobile phase additives can effectively improve the peak shape of target analytes in the obtained data and/or eliminate or at least reduce ion suppression. The method is particularly suitable for anionic compounds, such as phosphorylated compounds.

【技术实现步骤摘要】
经改进的用于阴离子化合物的液相色谱法
本公开总体上涉及经改进的液相色谱法。具体而言，本公开涉及经改进的总体上使用液相色谱-质谱(LC-MS)系统用于分离和分析化合物的方法。所述方法特别适合阴离子化合物，例如磷酸化化合物。
技术介绍
在液相色谱(LC)系统中，由一种或多种溶剂组成的流动相在高系统压力下被驱动通过分离单元，分离单元通常以色谱柱的形式提供。在高效LC(HPLC)系统和超高效LC(UHPLC)系统中，系统压力可高达例如约1200bar。所述柱含有固定相，其在LC中通常以颗粒(例如二氧化硅珠)的填充床的形式提供。颗粒被配制和/或官能化以分离样品中不同的分析物或组分(例如化学化合物)。当样品流经柱时，样品接触固定相。样品的不同组分对固定相具有不同的亲和力。这导致不同的组分在液体流经柱时彼此分离。结果，不同的组分在不同时间从柱出口洗脱。因此，来自柱的液体输出包含一系列带，每条带由样品的不同组分组成。也就是说，这些带分别由样品的不同组分组成，所述组分是通过柱彼此分离的。流动相和其中携带的一系列带从柱出口流到检测器，所述检测器被配置为检测每条单独的带。作为一个例子，检测器可以包括液体流经的流动池、光源和光检测器，所述光检测器被配置为对流经流动池的液体进行基于光学的测量(例如吸光度)。然后，可以利用检测器产生的电信号来产生色谱图。通常，色谱图将信号强度标绘为保留时间的函数，或者标绘为保留体积的函数。数据曲线显示为与检测器所检测到的一系列单独的带相对应的一系列峰值。在分析色谱中，色谱图用于鉴定样品中的组分，并指示它们在样品中的相对浓度。或者，在制备色谱中，可利用柱的分离能力来纯化样品，例如从样品中所含的其他化合物中离析靶标化合物。LC系统可以与质谱(MS)系统联用，从而形成混合型LC-MS系统。质谱(MS)系统通常包含用于离子化所研究样品的组分的离子源、基于气相离子不同的质荷比(或m/z比，或更简单的“质量”)分离气相离子的质量分析仪、用于对分离的离子进行计数的离子检测器、以及用于根据需要处理来自离子检测器的输出信号以产生用户可解释的质谱的电子器件。通常，质谱是指示检测到的离子的相对丰度(例如，离子信号强度，例如对于每个检测到离子的离子计数数)作为其m/z比的函数的一系列峰。在混合型LC-MS系统中，从LC柱洗脱的经分离的化合物被引入MS系统的离子源中。化合物在离子源中被离子化，所得到的离子被转移到质量分析仪中，并在分辨质量的基础上进行检测。因此，混合型LC-MS系统能够从样品获得三维(3D)LC-MS数据，其特征在于：洗脱时间(或采集时间或保留时间)、离子丰度和通过MS分选的m/z比。历史上，利用有机溶剂和极性固定相(例如二氧化硅或氧化铝)进行LC。利用这种“正相色谱”，更多极性分析物结合到极性固定相上。这些分析物被柱保留，稍后洗脱。非极性分析物结合较弱，因此较早从柱中洗脱。从二十世纪八十年代开始，反相色谱(RPC)被广泛使用。在RPC中，使用水性溶剂或极性溶剂，并用疏水基团例如十八烷基链(C-18)官能化二氧化硅。在RPC中，洗脱顺序是相反的或颠倒的。非极性分析物将被非极性固定相保留较长时间，稍后洗脱。相反，极性较大的分析物不与官能化的二氧化硅结合，因此在极性流动相中较早洗脱。在生命科学中，RPC的一个问题是：重要的极性或离子生物分子即使与疏水柱的相互作用也非常小，并且倾向于在柱空隙体积附近洗脱。Pesek,JJ,Matyska,MT在：Wang,PG,He,H(编),HydrophilicInteractionChromatography(HILIC)andAdvancedApplications,CRCPress,BocaRaton,FL2011,第1-26页，第2页。为了克服这个问题，已经开发了离子配对技术或亲水相互作用色谱(HILIC)系统。使用诸如四丁基氢氧化铵或N,N二甲基己胺(DMHA)的试剂，与RPC联用的离子配对技术已取得一定成功。此外，已知离子配对试剂会污染LC系统和柱，而且决不可能被完全洗掉，这迫使用户将LC系统和柱专门用于一种特定应用。参见Cordell等人2008JChromB871115-124。另一方面，HILIC使用极性溶剂和同样为极性的固定相。溶剂通常含有大量有机溶剂例如乙腈，这导致极性亲水分析物与固定相的更多相互作用。然而，尚未开发出科学界广泛接受的稳健的HILIC柱和方法，部分原因如下一节所述。对于带高负电荷的生物分子例如核苷酸或具有多于一个羧酸基团的有机酸，在LC/MS实验中通常观察到差的峰形。参见Pesek等人2011JSepSci341-8。这个问题是重要的，因为良好的峰形能够提供(1)不同分析物之间良好的分辨率和(2)准确的定量。使用纳米-LC/MS系统证明了：差的峰形是由存在微量金属(特别是铁)引起的，所述微量金属通常从色谱系统内的各种来源中以很低的浓度发现。参见Myint等2009AnalChem817766-7772。Myint等人使用多胺键合的聚合物基apHeraTMNH2柱来分离有机酸和磷酸化代谢物。用螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)冲洗柱后，他们发现峰形显著改善。然而，在多次使用柱后，EDTA被冲出系统，峰形恶化。他们推测恶化归因于铵盐或有机溶剂中的金属杂质。Myint等人通过将EDTA共注入流动相中克服了这个问题。Myint等人在7769。使用二氧化硅氢化物固定相的其他工作者研究了向流动相中加入EDTA以螯合系统中的金属，作为改善色谱法的手段。PesekJJ等人,2011JSepSci343509-3516。他们研究了(i)用EDTA冲洗系统，(ii)向流动相中加入EDTA，或(iii)用EDTA制备样品。EDTA的加入导致靶标分析物的峰形得到改善。然而，EDTA可保留在HILIC柱上并引起靶标化合物的离子抑制(参见本文中的图1A-1B和图2A-2B，以及PesekJJ等人，2011)。此外，当流动相中含有EDTA时，质谱仪不能以正离子模式使用，因为其在正离子模式分析中具有高离子化效率，从而使得该方法局限于使用质谱仪进行负离子模式分析。
技术实现思路
为了全面或部分地解决上述需求和/或本领域技术人员可能已经观察到的其他需求，本公开提供了方法、工艺、系统、设备、仪器和/或装置，如在下文所述实现方式中举例描述的那样。根据一个实施方式，本公开提供了一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：提供填充有固定相的液相色谱柱；提供包含一种或多种溶剂和亚撑二磷酸(medronicacid)添加剂的流动相；将所述样品注入所述流动相中；通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。在上述方法中，液相色谱柱可以是高效液相色谱(HPLC)柱。或者，液相色谱柱可以是超高效液相色谱(UHPLC)柱。在上述方法中，液相色谱柱可以是亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱。在另一个实施方式中，液相色谱柱可以是反相液相色谱(RPLC)柱。在一个实施方式中，可以使用以离子配对模式运行的反相液相色谱(RPLC)柱来进行所述方法。在又一个实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：提供填充有固定相的液相色谱柱；提供包含一种或多种溶剂和甲撑二磷酸添加剂的流动相；将所述样品注入所述流动相中；通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。

【技术特征摘要】
2017.08.31 US 15/692,7501.一种通过与质谱联用的液相色谱分析样品中的一种或多种分析物的方法，所述方法包括：提供填充有固定相的液相色谱柱；提供包含一种或多种溶剂和甲撑二磷酸添加剂的流动相；将所述样品注入所述流动相中；通过使含有所述样品的所述流动相流经所述液相色谱柱，在分离所述液相色谱柱中的所述一种或多种分析物的条件下进行色谱；和利用质谱仪分析一种或多种分离的分析物。2.权利要求1所述的方法，其中所述甲撑二磷酸添加剂当所述一种或多种分析物全部被分离时都存在。3.权利要求1所述的方法，其中所述甲撑二磷酸添加剂只有当所述一种或多种分析物中的一些被分离时才存在。4.权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱柱选自由如下组成的组：亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱；反相液相色谱(RPLC)柱；以离子配对模式运行的反相液相色谱(RPLC)柱；和尺寸排斥柱。5.权利要求1所述的方法，其中所述质谱以正模式分析和负模式分...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔迪·J·荷斯奥，洪峰·尹，奥斯卡·G·波特，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US