Mettl3敲除的精子发生障碍动物模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供Mettl3敲除的精子发生障碍动物模型及其构建方法，所述方法包括：应用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物，和将所述Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物与表达Cre的生殖细胞特异表达的同类啮齿类动物进行交配，从而获得生殖细胞特异的Mettl3敲除的精子发生障碍啮齿类动物模型。本发明专利技术构建得到的精子发生障碍动物模型为人类男性不育病因诊断、预防和治疗以及预防减少父源性出生缺陷等提供了新的思路和新手段。

Animal Model of Spermogenesis Disorder with Mettl 3 Knockout and Its Construction Method

The present invention provides an animal model of spermatogenesis disorder caused by Mettl 3 knockout and its construction method. The methods include: constructing rodents with Mettl 3 conditional gene knockout by CRISPR/Cas9 technology, mating rodents with the same rodents expressing Cre conditional gene to obtain Mettl 3 specific germ cell. A rodent model of spermatogenesis disorder due to ttl3 knockout. The animal model of spermatogenesis disorder constructed by the invention provides a new idea and a new means for the diagnosis, prevention and treatment of human male infertility and for the prevention and reduction of paternal birth defects.

【技术实现步骤摘要】
Mettl3敲除的精子发生障碍动物模型及其构建方法
本专利技术涉及Mettl3敲除的精子发生障碍动物模型及其构建方法。
技术介绍
不育不孕症作为一个危害全球公共健康的大问题，影响着约10-15％育龄夫妇，其中男方因素占50％。临床上的非阻塞性无精症、少精症、弱精症及畸精症是精子发生障碍的主要表现；同时，精子发生障碍也是自发性流产和胚胎发育异常的重要原因之一。然而，目前对精子发生异常的确切机制所知甚少。精子发生过程包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子变态三个不同阶段。以小鼠为例，就精原细胞增殖而言，首先是单个型精原细胞(Asinglespermatogonia，As)通过自我更新或增殖形成配对型精原细胞(Apairedspermatogonia，Ap)，Ap进一步增殖生成链状型精原细胞(Aalignedspermatogonia，Aal)。As、Ap以及Aal统称为未分化精原细胞。Aal未经有丝分裂直接转化形成A1型精原细胞，该过程称为精原细胞分化。A1型精原细胞经过五次有丝分裂逐次形成A2、A3、A4、中间型(In型)直至B型精原细胞。A1至B型精原细胞统称为分化型精原细胞。B型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建精子发生障碍啮齿类动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：应用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物，和将所述Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物与表达Cre的生殖细胞特异表达的同类啮齿类动物进行交配，从而获得生殖细胞特异的Mettl3敲除的精子发生障碍啮齿类动物模型；优选地，所述啮齿类动物为小鼠；优选地，所述Mettl3基因的序列为Genbank登陆号NC_000080.6所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种构建精子发生障碍啮齿类动物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：应用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物，和将所述Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物与表达Cre的生殖细胞特异表达的同类啮齿类动物进行交配，从而获得生殖细胞特异的Mettl3敲除的精子发生障碍啮齿类动物模型；优选地，所述啮齿类动物为小鼠；优选地，所述Mettl3基因的序列为Genbank登陆号NC_000080.6所示的序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述应用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物包括构建基因敲入载体的步骤，其中，所述基因敲入载体含有待敲入的基因序列、位于该待敲入的基因序列两端的LoxP序列、以及分别位于两个LoxP序列两端的5’同源臂序列和3’同源臂序列，所述基因敲入载体用于将LoxP位点及它们之间的待敲入的基因序列同源重组到啮齿类动物Mettl3基因的预定位置上；优选地，所述待敲入的基因序列为Mettl3外显子4。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述应用CRISPR/Cas9技术构建Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物包括：(1)根据待敲入位置两侧的序列，设计序列特异的sgRNA，构建sgRNA的表达质粒；(2)将Cas9表达质粒以及步骤(1)构建得到的sgRNA的表达质粒线性化，以线性化的质粒为模板进行体外转录，获得Cas9mRNA和sgRNA；(3)将所述Cas9mRNA、sgRNA以及所述基因敲入载体显微注射至啮齿类动物受精卵的胞质，将注射后的受精卵移植到假孕的雌性啮齿类动物的输卵管内，从而构建得到在Mettl3基因的预定位置上插入含两个LoxP序列及位于两个LoxP序列之间的待敲入基因序列的Mettl3条件性基因敲除的啮齿类动物。4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，所述精子发生障碍啮齿类动物模型为精原干细胞特异性Mettl3基因敲除小鼠模型Mettl3fl/del,Vasa-Cre，所述方法包括使Mettl3条件性基因敲除小鼠与Vasa-cre小鼠交配，构建得到所述精原干细胞特异性M...

【专利技术属性】
技术研发人员：童明汉，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31