用于检测核酸突变的组合物和方法技术

本发明专利技术提供用于在样品或其部分（在某些实施例中，包括含有循环肿瘤DNA的部分）中检测靶基因中的突变的方法和组合物。该方法可以包括覆瓦式PCR反应，例如单边多重覆瓦式反应。实际上，可以用所述方法和组合物检测任何类型的突变。在某些实施方案中，检测基因融合。提供了改进的PCR方法，尤其是用于进行巢式多重PCR反应的方法。

Compositions and Methods for Detecting Nucleic Acid Mutations

The present invention provides methods and compositions for detecting mutations in target genes in samples or parts thereof (in some embodiments, including parts containing circulating tumor DNA). The method may include imbricated PCR reactions, such as unilateral multiple imbrication reactions. In fact, any type of mutation can be detected using the methods and compositions described. In some implementations, gene fusion is detected. An improved PCR method is provided, especially for nested multiple PCR.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测核酸突变的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年07月01日提交的美国临时申请序列号62/357,847的利益，该申请的全文以引用方式合并入本文。序列表本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且其全文以引用的方式合并入本文中。所述ASCII副本被创建于2017年06月29日，被命名为N_017_WO_01_SL.TXT，并且大小为83,468字节。
所公开的本专利技术大体涉及使用例如聚合酶链式反应(PCR)的扩增方法来检测核酸突变和融合的方法。
技术介绍
与疾病(包括癌症)相关的突变的检测，无论是在诊断之前、在做出诊断中用于疾病分期还是监测治疗效果，传统上都依赖于实体肿瘤活检样品。这样取样是高度侵入性的，并且并非没有潜在地促进转移或手术并发症的风险。对于疾病或发育异常是决定性的突变，可以被认为是染色体易位、中间缺失、单核苷酸变异(SNV)、倒位、单核苷酸多态性(SNP)、插入、缺失、取代、及其组合。染色体易位或基因融合可以与已知参与各种癌症的基因相关，该基因包括AKT1、ALK、BRAF、EGFR、HER2、KRAS、MEK1、MET、NRAS、PIK3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在来自哺乳动物的样品或其部分中检测靶基因中的突变的方法，所述方法包含：a）通过将聚合酶、脱氧核苷三磷酸、来自由所述样品产生的核酸文库的核酸片段、一系列正链正向靶特异性引物和正链反向通用引物进行组合，从而形成初始反应混合物，其中所述核酸片段包含反向通用引物结合位点，其中一系列正向靶特异性引物包含结合至一系列覆瓦式靶特异性引物结合位点的5至250个引物，所述靶特异性引物结合位点在所述靶基因上以10至100个核苷酸间隔开；b）使所述初始反应混合物经历初始扩增条件，以产生使用引物对产生的靶扩增子，所述引物对包含所述一系列正向靶特异性引物中的引物中的一个和所述反向通用引物；以及c）分析所述靶...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.01 US 62/357,8471.一种用于在来自哺乳动物的样品或其部分中检测靶基因中的突变的方法，所述方法包含：a）通过将聚合酶、脱氧核苷三磷酸、来自由所述样品产生的核酸文库的核酸片段、一系列正链正向靶特异性引物和正链反向通用引物进行组合，从而形成初始反应混合物，其中所述核酸片段包含反向通用引物结合位点，其中一系列正向靶特异性引物包含结合至一系列覆瓦式靶特异性引物结合位点的5至250个引物，所述靶特异性引物结合位点在所述靶基因上以10至100个核苷酸间隔开；b）使所述初始反应混合物经历初始扩增条件，以产生使用引物对产生的靶扩增子，所述引物对包含所述一系列正向靶特异性引物中的引物中的一个和所述反向通用引物；以及c）分析所述靶扩增子中的至少一部分的核酸序列，从而检测所述靶基因中的突变。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析包含：使用大规模平行测序来确定所述靶扩增子中的至少一部分的核酸序列。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述正链正向靶特异性引物是正链正向靶特异性外部引物，并且所述正链反向通用引物是正链反向通用外部引物，并且其中所述方法在所述分析之前还包括：a）通过将外部引物靶扩增子、聚合酶、脱氧核苷三磷酸、反向内部通用引物和一系列正向靶特异性内部引物进行组合，从而形成内部引物反应混合物，所述靶特异性内部引物包含结合至一系列覆瓦式靶特异性内部引物结合位点的5至250个引物，所述靶特异性内部引物结合位点在靶基因上以10至100个核苷酸间隔开并且每个都在至少一个外部引物靶扩增子上被发现，所述一系列正向靶特异性内部引物被配置成在与一系列靶特异性外部引物相同的方向上引发延伸反应；以及b）使所述内部引物反应混合物经历内部引物扩增条件，以产生使用引物对产生的内部引物靶扩增子，所述引物对包含所述正向靶特异性内部引物中的一个和所述反向内部通用引物，其中其核酸序列被分析的扩增子包含所述内部引物靶扩增子，其中被分析的核酸序列是所述外部引物靶扩增子的一部分。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶特异性内部引物结合位点与靶特异性外部引物结合位点重叠0至25个核苷酸。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述反向内部通用引物包含与反向外部通用引物相同的核苷酸序列。6.根据权利要求3所述的方法，其中一系列覆瓦式靶特异性外部引物结合位点和所述靶特异性内部引物结合位点在1至100个靶基因中的每一个的靶区域上被发现。7.根据权利要求6所述的方法，其中在1至100个靶基因中的每一个上，所述外部引物靶扩增子中的至少50％或至少75％与所述外部引物靶扩增子中的至少另外一个具有重叠序列，其中每个靶区域包含500至10,000个核苷酸并且其中所述靶区域包含与疾病相关的已知突变。8.根据权利要求3所述的方法，其中所述外部引物靶扩增子中的至少50％和所述内部引物靶扩增子中的至少一个具有重叠序列。9.根据权利要求7所述的方法，进一步包含：a）通过将聚合酶、脱氧核苷三磷酸、来自由所述样品产生的核酸文库的核酸片段、一系列负链正向靶特异性外部引物和负链反向外部通用引物进行组合，从而形成负链外部引物反应混合物，其中所述核酸片段包含负链反向外部通用引物结合位点，其中所述一系列负链正向靶特异性外部引物包含结合至一系列覆瓦式负链正向靶特异性外部引物结合位点的5至250个引物，所述负链正向靶特异性外部引物结合位点在靶基因上以10至100个核苷酸间隔开，其中所述负链正向靶特异性外部引物结合位点位于被所述靶特异性外部引物靶定的链的负链上；b）使所述负链外部引物反应混合物经历扩增条件，以产生使用引物对产生的负链外部引物靶扩增子，所述引物对包含所述一系列负链正向靶特异性外部引物中的引物中的一个和所述负链反向外部通用引物；以及c）分析所述负链外部引物靶扩增子中的至少一部分的核酸序列，从而检测所述靶基因中的突变。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法在所述分析之前进一步包含：a）通过将所述负链外部引物靶扩增子、聚合酶、脱氧核苷三磷酸、负链反向内部通用引物和一系列正向负链靶特异性内部引物进行组合，从而形成负链内部引物扩增反应混合物，所述正向负链靶特异性内部引物包含结合至一系列覆瓦式负链靶特异性内部引物结合位点的5至250个引物，所述负链靶特异性内部引物结合位点在靶基因上以10至100个核苷酸间隔开并且每个都在至少一个负链外部引物靶扩增子上被发现，所述正向负链靶特异性内部引物被配置成在与一系列负链靶特异性外部引物相同的方向上引发延伸反应；以及b）使负链反应混合物经历负链靶特异性内部引物扩增条件，以形成使用引物对产生的负链内部引物靶扩增子，所述引物对包含负链正向靶特异性内部引物中的一个和负链内部通用引物，其中其核酸序列被分析的扩增子包含所述负链内部引物靶扩增子。11.根据权利要求9所述的方法，其中负链外部引物扩增条件与外部引物扩增条件相同。12.根据权利要求10所述的方法，其中负链内部引物扩增条件与所述内部引物扩增条件相同。13.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。14.根据权利要求1或3所述的方法，其中在外部引物靶扩增子和/或内部引物靶扩增子上，来自所述靶基因的至少25个连续的核苷酸和没有在所述靶基因上被发现的来自所述哺乳动物的基因组的区域的至少25个连续的核苷酸的存在，表示包含所述靶基因的基因融合。15.根据权利要求1或3所述的方法，其中一系列正链靶特异性外部引物包含至少一个结合至靶引物结合位点的引物，所述靶引物结合位点与所述靶基因的已知融合断裂点相距25至150个核苷酸，并且其中外部引物靶扩增子包含至少150个核苷酸长的扩增子。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法检测来自至少一种融合伴侣基因的基因融合，所述融合伴侣基因选自AKT1、ALK、BRAF、EGFR、HER2、KRAS、MEK1、MET、NRAS、PIK3CA、RET和ROS1。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述基因融合包含染色体易位。18.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法检测来自至少两种融合伴侣基因的基因融合，所述融合伴侣基因选自AKT1、ALK、BRAF、EGFR、HER2、KRAS、MEK1、MET、NRAS、PIK3CA、RET和ROS1，并且其中一系列靶特异性外部引物包含至少一个结合至靶引物结合位点的引物，所述靶引物结合位点与所述靶基因中的每一个的已知融合断裂点相距25至150个核苷酸，并且其中所述外部引物靶扩增子包含至少150个核...

【专利技术属性】
技术研发人员：伯恩哈德·齐默尔曼，约书亚·巴比亚尔兹，拉赫勒·萨拉里，图德·庞皮利厄·康斯坦丁，奥努尔·萨卡里亚，丹尼斯·普罗森，亚历山大·奥尔森，斯科特·达什纳，尼古拉·谢尔盖耶夫，马修·迈卡·希尔，
申请(专利权)人：纳特拉公司，
类型：发明
国别省市：美国,US