用于微生物共培养的组合物和方法技术

本文提供了用于生产γ‑聚谷氨酸(PGA)的组合物和方法。具体地，本文提供了用于生产PGA的细菌共培养系统和方法。

Compositions and methods for co-culture of microorganisms

Compositions and methods for the production of gamma polyglutamic acid (PGA) are provided. Specifically, this paper provides a bacterial co-culture system for PGA production.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于微生物共培养的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年5月26日提交的临时专利申请62/341,984的优先权，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦政府资助的研究或开发的声明本专利技术是在由国家科学基金会(NationalScienceFoundation)授予的拨款号1355957和1448990的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术中的某些权利。专利
本文提供了用于生产γ-聚谷氨酸(PGA)的组合物和方法。具体地，本文提供了用于生产PGA的微生物共培养系统和方法。专利技术背景γ-聚谷氨酸(PGA)是谷氨酸的阴离子聚合物，其由于其独特的可吸收的、无毒的、可生物降解的、非免疫原性的以及富含可用的羧酸基团(Bajaj和Singhal，2011)的特性，具有大范围的潜在商业应用。PGA是相对较新的材料，但对其的商业利益正在增长。PGA可以通过谷氨酸的化学聚合或经由微生物生物合成来生产，其中后者更具成本效益。然而，微生物生物合成需要添加柠檬酸和其他试剂，这增加了成本。需要用于生产PGA的改进方法。
技术实现思路
本文提供了用于生产γ-聚谷氨酸(PGA)的组合物和方法。具体地，本文提供了用于生产PGA的细菌共培养系统和方法。在一些实施方式中，本文提供了生产γ-聚谷氨酸(PGA)的方法，包括：a)使真菌与第一原料接触；b)发酵该真菌以产生柠檬酸；c)使来自步骤b)的柠檬酸与芽孢杆菌属(Bacillussp.)和第二原料接触；以及d)发酵该芽孢杆菌属(Bacillussp.)细菌以产生PGA。在一些实施方式中，该一个或多个步骤还包括添加甘油、谷氨酸或谷氨酰胺中的一种或多种。在一些实施方式中，步骤b)和d)在相同或不同的生物反应器中进行。本公开不限于特定的真菌。实例包括但不限于黑曲霉(Aspergillusniger)，解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或假丝酵母(Candidaoleophila)。本公开不限于特定细菌。实例包括但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(例如，菌株IFO3335、TAM-4、C1、C10、chungkookjang、NX-2、MR-141、CGMCC0833、R23、ER1001、ER1007、ER1064、ER1012或RKY3)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(例如，菌株SAB-26、A35、ATCC9945、CC12826、WBL-3或NCIM2324)。在一些实施方式中，在步骤b)之后分离柠檬酸。在一些实施方式中，第一和第二原料选自，例如，糖蜜、提余液、果渣、果皮、玉米淀粉、小麦淀粉、高粱、啤酒厂废弃物、玉米秸秆、废藻饼或甘油。在一些实施方式中，第一和第二原料是来自农作物和食品加工、生物燃料或生物化学品生产或生物柴油生产的副产物。在一些实施方式中，生物反应器包括选自例如分布器、混合/搅拌系统、温度控制系统、pH控制系统或消泡控制系统的一种或多种组件。在一些实施方式中，混合/搅拌系统是例如由马达驱动的叶轮、涡轮或桨叶中的一种或多种。在一些实施方式中，步骤a)或b)还包括使真菌细菌与一种或多种选自例如氮源、磷源、碳源、盐或一种或多种额外营养素的额外成分接触。在一些实施方式中，氮源以约0.1-50g总N/L的浓度存在，并且选自例如酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、玉米浸出液、麦芽提取物、大豆豆粉、大豆胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3或NaNO3。在一些实施方式中，磷源以约0.1-25g总P/L的浓度存在，并且选自例如KH2PO4、K2HPO4或Na2HPO4。在一些实施方式中，第一和第二原料以2.5-75％v/v或50-250g/L的浓度存在。在一些实施方式中，盐选自，例如，KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、MgSO4、FeCl3、FeCl2、CaCl2、MnSO4、NaCl、KCl和Na2SO4。在一些实施方式中，该一种或多种营养素是生物素和/或维生素。在一些实施方式中，步骤a)和b)以约0.1至2vvm的通气速率，约2-8的pH，约25-50℃的温度和约50-1000ppm的搅拌速率进行。另外的实施方式提供了系统，包括：a)第一生物反应器，包括真菌和第一原料；b)第二生物反应器，包括在第一生物反应器中发酵的柠檬酸、芽孢杆菌属(Bacillussp.)和第二原料。进一步实施方式提供了系统，包括：生物反应器，包括真菌、第一原料，从真菌发酵的柠檬酸，芽孢杆菌属(Bacillussp.)和第二原料。本文描述了另外的实施方式。附图说明图1示出了用于经由原位前体生产(ISPP)制造PGA的示例性共培养。图1示出了用于生产PGA的具有谷氨酸非依赖性芽孢杆菌属(Bacillussp.)的示例性分区连续生物反应器培养物。图2示出了用于生产PGA的具有谷氨酸非依赖性芽孢杆菌属(Bacillussp.)的示例性合并连续培养物。图3示出了经由黑曲霉NRRL599(A.nigerNRRL599)和生产PGA的芽孢杆菌属NRRL14202(Bacillussp.NRRL14202)的分区连续培养物的PGA生产。(A)对固体培养基分区连续培养方法。(B)经由在板上出现黏液状菌落的PGA生产的证据。(C)通过SDS-PAGE证实PGA。图4示出了在分区连续培养物(“黑曲霉(NGPP)”系列)和用商购柠檬酸和与用黑曲霉(A.niger)上清液配制的培养基相似的蔗糖浓度配制的对照培养物(“NGPP蔗糖对照”系列)中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NRRL14202O的生长(在不同时间点的OD600)。图5示出了在分区连续培养物(“黑曲霉(NGPP)”系列)和用商购柠檬酸和与用黑曲霉(A.niger)上清液配制的培养基相似的蔗糖浓度配制的对照培养物(“NGPP蔗糖对照”系列)中用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NRRL14202O的PGA生产(PGA滴度，g/L，在终点)。图7示出了解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)培养物中的柠檬酸产生和甘油消耗(在接种芽孢杆菌(Bacillussp)之前)图8示出了解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)培养物中的柠檬酸产量(在接种芽孢杆菌(Bacillussp)之前)图9示出了分区连续共培养物(A1-3)，合并连续共培养物(B1-6)和对照(C1-3)中的甘油消耗。图10示出了分区连续共培养物(A1-3)，合并连续共培养物(B1-6)和对照(C1-3)中的柠檬酸消耗。图11示出了对于解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)NRRL1094/芽孢杆菌属(Bacillussp.)ER1064分区连续共培养物(A1-3)、合并连续共培养物(B1-6)和对照(C1-3)的PGA滴度图12示出了对于解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)NRRL1094/芽孢杆菌属(Bacillussp.)ER1064分区连续共培养物(A1-3)、合并连续共培养物(B1-6)和对照(C1-3)的PGA产量和产率图13示出了对于芽孢杆菌属(Bacillussp.)菌株ER1001、ER1007和ER1012的单培养物的PGA滴度(g/L)、产量(g/gC源本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产γ‑聚谷氨酸(PGA)的方法，包括：a)使真菌与第一原料接触；b)发酵所述真菌以产生柠檬酸；c)使来自步骤b)的所述柠檬酸与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和第二原料接触；和d)发酵所述芽孢杆菌属以产生PGA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.26 US 62/341,9841.一种生产γ-聚谷氨酸(PGA)的方法，包括：a)使真菌与第一原料接触；b)发酵所述真菌以产生柠檬酸；c)使来自步骤b)的所述柠檬酸与芽孢杆菌属(Bacillussp.)和第二原料接触；和d)发酵所述芽孢杆菌属以产生PGA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a-d)中的一个或多个还包括添加甘油、谷氨酸或谷氨酰胺中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤b)和d)在相同或不同的生物反应器中进行。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述真菌是黑曲霉(Aspergillusniger)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)或假丝酵母(Candidaoleophila)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述芽孢杆菌属是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述枯草芽孢杆菌是选自由IFO3335、TAM-4、C1、C10、chungkookjang、NX-2、MR-141、CGMCC0833、R23、ER1001、ER1007和ER1012，以及RKY3组成的组的菌株。7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述地衣芽孢杆菌是选自由SAB-26、A35、ATCC9945、CC12826、WBL-3和NCIM2324组成的组的菌株。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述柠檬酸在所述步骤b)之后分离。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述第一和第二原料选自由糖蜜、提余液、果渣、果皮、玉米淀粉、小麦淀粉、高粱、啤酒厂废弃物、玉米秸秆、废藻饼和甘油组成的组。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一和第二原料是来自农作物和食品加工、生物燃料或生物化学生产或生物柴油生产的副产物。11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述生物反应器包括选自由分布器、混合/搅拌系统、温度控制系统、pH控制系统和消泡控制系统组成的组的一种或多种组件。12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述混合/搅拌系统选自由马达驱动的叶轮、涡轮和桨叶组成的组。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述步骤a)和/或b)还包括使所述真菌或细菌与选自由氮源、磷源、碳源、盐和一种或多种额外营养素组成的组的一种或多种额外成分接触。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述氮源以0.1-50g总N/L的浓度存在，并且选自由酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、玉米浸出液、麦芽提取物、大豆豆粉、大豆胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、和NaNO3组成的组。15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述磷源以0.1-25g总P/L的浓度存在，并且选自由KH2PO4、K2HPO4和Na2HPO4组成的组。16.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第一和第二原料以2.5-95％v/v或50-250g/L的浓度存在。17.根据权利要求13所述的方法，其中，所述盐选自由KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、MgSO4、FeCl3、FeCl2、CaCl2、MnSO4、NaCl、KCl和Na2SO4组成的组。18.根据权利要求13所述的方法，其中，所述一种或多种营养素是生物素和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰里米·明蒂，马克·E·辛格，林晓霞，大卫·博耶，
申请(专利权)人：密执安大学评议会，
类型：发明
国别省市：美国,US