一种缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种缓释SDF‑1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，它包括以下步骤：（1）、称取0.5g胶原粉末加入盛有乙酸溶液的瓶中，充分溶解，调节胶原溶液PH至7.2得胶原溶液A；（2）、称取SA粉末缓缓加入加入至双蒸水中，24h后待SA完全溶解，得SA溶液B；（3）、称取CaCO3粉末加入至双蒸水中，得CaCO3溶液C；（4）、称取葡萄糖内酯粉末加入至双蒸水中，获得GDL溶液D；（5）、将胶原溶液A与SA溶液B等体积混合得复合溶液E；（6）、将溶液E、溶液C和溶液D按相应体积比混匀后滴加SDF‑1溶液得产品；该复合水凝胶对骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性，能够改善TBI大鼠学习记忆能力和神经缺损情况。

Preparation of collagen/sodium alginate composite hydrogel with sustained-release SDF-1

The invention discloses a preparation method of collagen/sodium alginate composite hydrogel with sustained-release SDF_1, which comprises the following steps: (1) weighing 0.5g collagen powder into a bottle containing acetic acid solution, fully dissolving, adjusting collagen solution PH to 7.2 to obtain collagen solution A; (2) weighing SA powder and slowly adding it into double-steamed water, 24 hours later waiting for SA to completely dissolve, to obtain SA solution B; (3) (4) adding glucose lactone powder to double-steaming water to obtain GDL solution D; (5) mixing collagen solution A and SA solution B to get composite solution E; (6) mixing solution E, solution C and solution D according to the corresponding volume ratio and adding SDF 1 solution to get product; the composite hydrogel is used for bone marrow mesenchymal. Mesenchymal stem cells have good cell compatibility and can improve learning and memory ability and neurological deficits in TBI rats.

【技术实现步骤摘要】
一种缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法
本专利技术属于生物医学材料领域，具体涉及一种缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法。
技术介绍
创伤性脑损伤(traumaticbraininjury，TBI)是一种具有高发病率、高致死率的中枢神经系统缺损性疾病，而创伤部位由于缺乏充足的血液和营养输送导致其神经修复和再生十分有限。干细胞移植能有效治疗肝、肾、神经等损伤性疾病，促进损伤区细胞的再生，但由于移植干细胞易流失且成活率低等特点，严重制约了干细胞移植的应用。上世纪80年代以来，组织工程技术不断发展和完善，为人类解决脑损伤这一难题带来了希望。利用组织工程技术，选择具有良好生物相容性的可降解支架材料，并对支架材料进行三维结构的改造，进而改善干细胞生存微环境、增加干细胞的靶向迁移能力，对于提高干细胞的移植效果至关重要。可注射水凝胶(Injectablehydrogel）具有高水含量、与ECM的相似性、多孔结构、最小侵入性质等特点，已成为组织工程领域的“明星”材料。常见生物衍生支架材料，如胶原/明胶、海藻酸钠、透明质酸、纤维蛋白肝素等，具有天然自带的活性基团，与人工合成支架相比具有无免疫原性，能促进干细胞的增殖、粘附、迁移和分化等作用。I型胶原（Collagen,Col）是能够调控细胞功能的一种细胞外基质蛋白，能够以水凝胶的形式研制出神经再生支架，用于构建细胞培养和定向分化的3D微环境。胶原支架可以促进人间充质干细胞在脑损伤部位的迁移和存活，提高干细胞治疗效果。海藻酸钠（SodiumAlginate，SA）是从褐藻中提取的水溶性聚醛酸，具有良好的生物相容性，有利于神经轴突的生长和细胞的迁移，能够促进脊髓损伤的功能恢复与神经再生。因此，将SA溶液和Col溶液交联构建出新型Col/SA神经支架，为干细胞提供生存的微环境，促进TBI的神经修复与再生。基质细胞衍生因子-1(stromalcellderivedfactor1,SDF-1)及其受体CXCR4趋化因子12(CXCL12)是干细胞趋化、活化和归巢的关键因子。有研究发现，在TBI损伤区域周围SDF-1的表达量会增加，因而，增加对损伤诱导的SDF-1的移植敏感性是提高干细胞移植效果的关键。具有局部释放SDF-1的支架治疗效果明显优于无释放SDF-1的对照组支架。目前国内外主要是进行PLGA、PLA、HA/Lamini等人工合成材料与SDF-1结合的研究，尚无利用Col/SA支架材料包载SDF-1进行TBI神经修复与再生的研究。同时有报道发现，SDF-1对干细胞的趋化效果具有二重性，浓度过高趋化归巢效果减弱，而浓度过低者则达不到明显的趋化效果。因此本专利技术完善了SDF-1释放系统，利用Col/SA复合水凝胶缓慢释放SDF-1，使SDF-1持续稳定的释放，从而达到其趋化效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，研发一种缓释SDF-1并且具有良好生物相容性的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，用以解决SDF-1释放快、降解快、利用率较低，达不到对BMSCs趋化作用的缺点；同时本专利技术利用Col、SA等与细胞外基质相似的凝胶材料，将其与SDF-1复合，制备出在一段时间内持续缓慢释放SDF-1因子的SDF-1/Col/SA复合水凝胶，而且这种复合水凝胶对骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有良好的细胞相容性，负载BMSCs的SDF-1/Col/SA水凝胶移植治疗TBI大鼠，能够改善其学习记忆能力和神经缺损情况，从而更好的修复脑损伤，实现对TBI大鼠的治疗。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一种缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，它包括以下步骤：（1）、在容量瓶中，称取575μL冰乙酸用双蒸水定容至100mL，得0.1M的乙酸溶液；用吸管吸取50mL的上述乙酸溶液，加入盛有0.5g胶原粉末的瓶中，颠倒使其充分溶解，用PH计调节胶原溶液PH至7.2，获得质量分数1%的胶原溶液A；（2）、将转子加入装有50mL双蒸水的玻璃瓶中，打开磁力搅拌器，分析天平称取1gSA缓缓加入至玻璃瓶中，24h后待SA完全溶解，获得质量分数2%的SA溶液B；（3）、称取0.05gCaCO3粉末加入至10mL双蒸水中，获得50mM的CaCO3溶液C；（4）、称取0.1184g葡萄糖内酯粉末加入至10mL的双蒸水中，获得100mM的GDL溶液D；（5）、将胶原溶液A与SA溶液B等体积混合，制得质量分数0.5%Col：1%SA的Col/SA的复合溶液E；（6）、将溶液E、溶液C和溶液D依次按体积比2：1：1充分混匀后缓慢滴加SDF-1溶液，以最终SDF-1的浓度150ng/mL，得到缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶。根据上述的缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，所述缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶为0.25%Col：0.5%SA的Col/SA的复合水凝胶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术制备SDF-1/Col/SA复合水凝胶是通过SA-CaCO3-GDL(Ca2+与COO-摩尔比0.5)体系所制备的海藻盐水凝胶呈半透明状，内部凝胶法可缓慢释放Ca2+，与传统CaCl2相比，凝胶时间可以根据需要控制，而Col/SA复合凝胶内部更加均一，有天然的网状交联孔隙，有利于种子细胞的黏附、增殖、分化，并且SDF-1/Col/SA复合水凝胶具有良好的生物相容性，细胞相容性，是一种适宜于组织工程神经修复的良好支架；SDF-1/Col/SA复合水凝胶可以缓释SDF-1，缓释时间能达到18天，大幅度提高了SDF-1的利用率，同时第一天释放量能达到40%，满足了定向趋化的浓度要求，解决了使用了大剂量SDF-1所造成的高成本问题；2、本专利技术产品对TBI的临床治疗提供了可靠的支架材料，经过动物实验证实，SDF-1/Col/SA复合水凝胶对TBI大鼠移植治疗21天至28天学习记忆能力明显改善，神经缺损得到了有效治疗。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为Col/SA、SDF-1/Col/SA凝胶外观图片；图2为SDF-1/Col/SA凝胶扫描电镜形貌特征；图3为Col/SA凝胶、SDF-1/Col/SA复合水凝胶的凝胶时间的变化；图4为Col/SA凝胶、SDF-1/Col/SA复合凝胶的含水率、降解率的变化；图5为ELISA实验检测SDF-1/Col/SA凝胶中SDF-1的缓释；图6为CCK-8实验检测BMSCs在SDF-1/Col/SA凝胶中1、3、5、7天的增殖；图7为吖啶橙（AO）-溴化乙锭(EB)双染法检测Col/SA凝胶、SDF-1/Col/SA凝胶对BMSCs生物活性的影响；图8为Transwell小室法检测Col/SA凝胶、SDF-1/Col/SA凝胶对BMSCs的迁移作用的影响；图9为TBI组大鼠与BMSCs/SDF-1/Col/SA组大鼠术后的体重变化；图10为TBI组大鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缓释SDF‑1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）、在容量瓶中，称取575μL冰乙酸用双蒸水定容至100mL，得0.1M的乙酸溶液；用吸管吸取50 mL的上述乙酸溶液，加入盛有0.5g胶原粉末的瓶中，颠倒使其充分溶解，用PH计调节胶原溶液PH至7.2，获得质量分数1%的胶原溶液A；（2）、将转子加入装有50mL双蒸水的玻璃瓶中，打开磁力搅拌器，分析天平称取1g SA缓缓加入至玻璃瓶中，24h后待SA完全溶解，获得质量分数2%的SA溶液B；（3）、称取0.05gCaCO3粉末加入至10mL双蒸水中，获得50mM的CaCO3溶液C；（4）、称取0.1184g葡萄糖内酯粉末加入至10mL的双蒸水中，获得100mM的GDL溶液D；（5）、将胶原溶液A与SA溶液B等体积混合，制得质量分数0.5%Col：1%SA的Col/SA的复合溶液E；（6）、将溶液E、溶液C和溶液D依次按体积比2：1：1充分混匀后缓慢滴加SDF‑1溶液，以最终SDF‑1的浓度150ng/mL，得到缓释SDF‑1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种缓释SDF-1的胶原/海藻酸钠复合水凝胶的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）、在容量瓶中，称取575μL冰乙酸用双蒸水定容至100mL，得0.1M的乙酸溶液；用吸管吸取50mL的上述乙酸溶液，加入盛有0.5g胶原粉末的瓶中，颠倒使其充分溶解，用PH计调节胶原溶液PH至7.2，获得质量分数1%的胶原溶液A；（2）、将转子加入装有50mL双蒸水的玻璃瓶中，打开磁力搅拌器，分析天平称取1gSA缓缓加入至玻璃瓶中，24h后待SA完全溶解，获得质量分数2%的SA溶液B；（3）、称取0.05gCaCO3粉末加入至10mL双蒸水中，获得50mM的CaCO3溶液C...

【专利技术属性】
技术研发人员：马珊珊，关方霞，周建康，张琨，姚明浩，黄团结，邢衢，刘腾飞，周馨魁，王亚苹，崔渊博，刘红涛，张彦婷，李庆华，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南,41